生物技术法处理对花生粕饲用品质影响的研究

侯德宝，蔡国林，朱德伟，吴殿辉，陆 健

(1.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡214122；2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；3.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122)

油料蛋白

生物技术法处理对花生粕饲用品质影响的研究

侯德宝1，2，3，蔡国林1，3，朱德伟1，3，吴殿辉1，3，陆 健1，2，3

(1.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡214122；2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；3.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122)

花生粕存在黄曲霉毒素B1(AFB1)易超标、非淀粉多糖含量高和蛋白质品质不佳等缺陷，利用微生物(枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳酸片球菌)发酵结合复合酶制剂处理花生粕，可以综合改善其饲用品质。研究表明：处理后花生粕中AFB1的去除率为94.6%，非淀粉多糖含量由30%降低至10.5%，蛋白质含量由47.8%提高至61.5%，大分子蛋白明显降解为小分子蛋白，小肽含量由5.36% 提高至25.21%，必需氨基酸总量提高了19.67%，乳酸含量由0.7%提高至2.8%。经过生物技术法处理，花生粕的饲用品质得到了明显改善。

花生粕；混合发酵；黄曲霉毒素B1；非淀粉多糖

花生粕是花生仁提取油脂后的副产品，花生粕中蛋白质含量高达48%左右，是一种潜在的优质蛋白饲料。但是花生粕容易感染黄曲霉，黄曲霉在生长代谢过程中会产生黄曲霉毒素B1(AFB1)，AFB1会对动物的肝脏造成伤害，并影响其生长性能[1]。国家饲料卫生标准(GB 13078—2001)规定花生粕中AFB1最高限量为50 μg/kg，配合饲料中AFB1的最高限量为10～20 μg/kg。目前市场上的花生粕基本都含有AFB1，污染严重者达到180 μg/kg[2]。花生粕还含有高达30%左右的非淀粉多糖(NSP)，多为难消化利用的纤维素和半纤维素[3]，过量的NSP会导致饲料蛋白质利用率降低，是植物源蛋白饲料中常见的抗营养因子。此外，花生粕中蛋白质品质不佳，如氨基酸不平衡(赖氨酸含量低)，肽含量也相对偏少，造成其消化率偏低[4]。上述饲用品质缺陷的存在，在一定程度上限制了花生粕在饲料行业的应用。

目前，对花生粕的研究主要有酶解生产抗氧化肽和抗菌肽，制备膳食纤维和发酵花生粕等。任晓静等[5]利用植物乳杆菌对花生粕进行固态发酵，发酵后蛋白质品质有所提升，但AFB1去除率仅为 44.61%，且可能存在AFB1解吸附的风险。徐铭乾[6]采用解淀粉芽孢杆菌对花生粕进行固态发酵，AFB1去除率达到81.39%，但对AFB1含量高(145.17 μg/kg)的花生粕发酵后仍能残留27.01 μg/kg的AFB1。目前的研究主要针对花生粕的个别饲用品质缺陷进行改善，且没有关注主要抗营养因子NSP的降解，导致产品难以高比例替代鱼粉等优质蛋白饲料。

本研究在现有的研究基础上，尝试采用微生物发酵并结合复合酶制剂的生物技术法处理花生粕，在高效降解花生粕中AFB1的同时，降低抗营养因子NSP的含量，提高蛋白质的品质，实现花生粕资源节约化和解决饲料安全性问题。

1 材料与方法

1.1 实验材料

花生粕，由山东鲁花集团有限公司提供；纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶，均购自白银赛诺生物科技有限公司；β-葡聚糖酶，购自康地恩生物科技有限公司；AFB1标准品(纯度大于99%)，甲醇、乙腈为色谱纯，购自Sigma公司；三氟乙酸为化学纯，正己烷为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司；氮气，购自无锡新南化学气体有限公司；SPE柱，购自无锡科奥美萃生物科技有限公司；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，均为实验室保藏菌株。

U3000高效液相色谱仪，美国Dionex公司；KT260凯氏定氮仪，福斯赛诺(苏州)分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生物技术法处理花生粕

花生粕(50 g)和水按1∶0.8比例混合，121℃灭菌20 min，冷却后接种二级活化的枯草芽孢杆菌，接种量10%，发酵72 h；取出后加水至料水比1∶3，添加复合酶制剂(纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶各以100 U/g添加，果胶酶以200 U/g添加)并置于45℃下酶解反应4 h；酶解反应后将样品进行沸水浴20 min，冷却后添加经二级活化好的酿酒酵母和乳酸片球菌，各接种5%，发酵48 h后固液分离，烘干、粉碎。

1.2.2 AFB1含量的测定

花生粕中AFB1含量用乙腈-水(84∶16)溶液提取，提取液经SPE柱净化，净化后的AFB1提取液进行柱前衍生，衍生后过0.45 μm微孔滤膜，采用高效液相色谱法测定AFB1的含量[5]。

1.2.3 NSP和还原糖含量的测定

NSP含量按总糖含量减去还原糖含量计算。

还原糖含量、总糖含量的测定参照文献[7]进行。

1.2.4 蛋白质含量的测定

按照GB 5009.5—2010方法测定蛋白质含量[8]。

1.2.5 花生粕中蛋白质的SDS-PAGE分析

称取处理前后的粉碎花生粕各1.000 0 g，加入10.00 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)浸提2 h，然后于3 000×g，4℃离心10 min，取上清液，再于10 000 r/min，4℃离心5 min，收集上清液用于SDS-PAGE电泳[5]。

1.2.6 小肽含量的测定

按照GB/T 22492—2008方法测定花生粕小肽的含量。

1.2.7 氨基酸组成的测定

按照GB/T 5009.124—2003方法测定氨基酸组成。

1.2.8 总酸含量的测定

采用0.1 mol/L标准NaOH溶液滴定，计算总酸含量(以乳酸计)[8]。

2 结果与讨论

2.1 AFB1含量的变化

经生物技术法处理后花生粕中AFB1含量的变化如图1所示。

由图1可知，处理前后花生粕中AFB1的含量明显降低，经计算，处理前其含量为169.28 μg/kg，处理后仅为9.14 μg/kg，AFB1的去除率达到94.6%。文献报道，饲料中添加0.2%的蒙脱石可有效解决饲料中AFB1污染问题；此外，水合氯硅酸钠钙、沸石、膨润土等吸附剂也能够有效吸附AFB1[9]。Luo等[10]用臭氧处理被AFB1污染的玉米，AFB1降解率约为80%。这些物理或化学方法虽然可以减少AFB1的含量，但费时、费力，且对花生粕的营养成分造成流失，还存在潜在的副作用。本研究利用农业部规定使用的有益微生物添加剂对花生粕进行混合发酵，AFB1含量低至9.14 μg/kg，远低于国家标准对花生粕中AFB1含量的限量要求(≤50 μg/kg)；也低于市场上配合饲料、水产饲料等对AFB1含量一般不得超过20 μg/kg的要求，明显提高了花生粕的应用范围。

图1 处理前(a)后(b)花生粕中AFB1含量的变化

2.2 NSP含量和还原糖含量的变化

本研究基于花生粕中NSP成分的特点，添加以纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶组成的复合酶制剂，考察酶解前后花生粕中NSP、还原糖含量的变化情况，结果如图2所示。

图2 处理前后花生粕中NSP、还原糖含量的变化

由图2可知，花生粕中NSP含量从30%降至10.5%，而还原糖含量则从0.45%提高至6.72%。NSP被酶解后，其产物可为后续的混菌发酵提供碳源，并转化成有益代谢产物，可以提高发酵水平。Hogberg等[11]曾对不同动物、同一动物的不同生长阶段两种条件下对NSP的抗营养作用进行了系统研究，在持续饲喂高NSP含量的日粮后，实验组家禽、幼龄牲畜的体重明显低于空白组 (P<0.05)，这表明家禽、幼龄阶段的牲畜对NSP的抗营养作用更敏感。因此，NSP含量的减少可降低花生粕的抗营养作用，提高其饲用品质。

2.3 蛋白质含量和小肽含量的变化

处理前后花生粕中蛋白质含量和小肽含量的变化如图3所示。

图3 处理前后花生粕中蛋白质、小肽含量的变化

由图3可知，经过处理后的花生粕中蛋白质含量由原来的47.8%提高到了61.5%，这主要是由于复合酶酶解了其中的NSP。同时，微生物发酵产生CO2，使蛋白质得到了一定程度的浓缩。目前市场上的饲料蛋白以鱼粉、发酵豆粕为主，一级鱼粉蛋白质含量都在60%以上，发酵豆粕的蛋白质含量也在50%以上。通过本研究处理后的花生粕中蛋白质含量可以达到一级鱼粉的水平，这也提高了花生粕在饲料蛋白市场的竞争力。处理后花生粕中的小肽含量也由5.36%提升至25.21%。小肽营养价值高，可以改善饲料适口性、减少仔猪腹泻、促进骨骼生长，其运转系统速度快、耗能低、不易饱和,对动物生长意义重大[12]。

通过SDS-PAGE考察处理前后花生粕中蛋白质的组成结构，评价生物技术法处理的花生粕中蛋白质的降解情况，结果见图4。

图4 处理前后花生粕中蛋白质的SDS-PAGE变化

由图4可知，经过处理后，蛋白质中的大分子蛋白质明显降解为小分子蛋白质。小分子蛋白质对肠道健康和功能发挥具有保护作用，可以促进肠道上皮细胞增殖，改善蛋白质代谢，提高肠道黏膜免疫功能和抗氧化能力，从而促进肠道发育[13]。

2.4 氨基酸组成的变化

用氨基酸自动分析仪测定处理前后花生粕中必需氨基酸组成的变化，结果见表1。

表1 处理前后花生粕中必需氨基酸组成的变化 %

注：-表示低于检出限。

由表1可知，处理后花生粕中必需氨基酸总量提高了19.67%。脊椎动物等自身无法合成必需氨基酸，而必需氨基酸在体内又是合成蛋白质必不可缺的要素。在肠道代谢过程中，必需氨基酸是小肠黏膜的重要能量物质，参与肠道内氨基酸、谷胱甘肽和多胺等多种生物活性物质的合成，必需氨基酸对维持肠黏膜的完整性和肠道功能有重要意义[14]。本研究处理后的花生粕，可整体提高必需氨基酸含量19.67%，赖氨酸含量提高了16.89%，蛋氨酸含量提高了18.00%，苏氨酸含量提高了25.17%，缓解了花生粕氨基酸不平衡的问题。

2.5 总酸含量的变化

本研究添加了乳酸菌对花生粕进行发酵实验，通过测定处理前后花生粕的pH和总酸含量(以乳酸计)，发现pH从处理前的6.39降至4.80，乳酸含量从处理前的0.7%提高至2.8%。饲料中添加乳酸菌可维持肠道菌群的微生态平衡，Demecková等[15]通过向多产母猪饲喂经植物乳杆菌发酵的液体饲料，发现其粪便中的大肠杆菌类细菌下降显著(P<0.01)。此外，花生粕呈酸性，在储藏过程中不易滋生沙门氏菌、大肠杆菌、霉菌等致病菌，可使花生粕的品质稳定。

3 结 论

利用微生物(枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳酸片球菌)发酵结合复合酶制剂的生物技术法处理花生粕，比较处理前和处理后花生粕中AFB1含量、NSP含量、蛋白质含量、小肽含量、氨基酸组成、总酸含量的变化，综合考察了生物技术法处理对花生粕品质的改善情况。研究发现，AFB1的去除率为94.6%。NSP从30%降至10.5%,还原糖从0.45%提高至6.72%。蛋白质含量由47.8%提高到61.5%，大分子蛋白明显降解为小分子蛋白，必需氨基酸总量提高19.67%；其中，赖氨酸含量提高了16.89%，蛋氨酸含量提高了18.00%，苏氨酸含量提高了25.17%。而有益代谢产物乳酸含量从0.7%提高到2.8%。经生物技术法处理后花生粕的品质有明显提高，尤其是AFB1的降解非常明显，蛋白质含量也大大提高。而生物技术法降解AFB1的机理有待进一步研究。

[1] 温琦, 苏从毅, 何武顺, 等. 饲料中真菌毒素的危害与限量[J]. 饲料广角, 2014(5): 32-36.

[2] 陈新, 王雄, 雷达. 免疫亲和-光化学柱后衍生高效液相色谱荧光法测定花生粕中黄曲霉毒素的研究[J].中国饲料, 2007(24): 30-34.

[3] MALATHI V, DEVEGOWDA G. In vitro evaluation of non-starch polysaccharide digestibility of feed ingredients by enzymes[J]. Poult Sci, 2001, 80 (3): 302-305.

[4] 梅娜, 周文明, 胡晓玉. 花生粕营养成分分析[J]. 西北农业学报, 2007, 16(3): 96-99.

[5] 任晓静, 蔡国林, 朱德伟, 等. 花生粕饲用品质改善的研究[J]. 中国油脂, 2013, 38(4): 18-22.

[6] 徐铭乾. 花生粕中黄曲霉毒素B1生物降解的初步研究[D]. 江苏 无锡: 江南大学, 2015.

[7] 王宪泽.生物化学实验技术原理和方法[M].北京：中国农业出版社，2002：77-80.

[8] 蔡国林, 郑兵兵, 王刚, 等.微生物发酵提高花生粕营养价值的初步研究[J]. 中国油脂, 2010, 35(5): 31-34.

[9] 史莹华, 许梓荣, 孙宇, 等. 蒙脱石纳米复合物吸附猪日粮中黄曲霉毒素B1效果的研究[J]. 动物营养学报, 2007, 19(6):742-747.

[10] LUO X H, WANG R, WANG L, et al. Effect of ozone treatment on aflatoxin B1and safety evaluation of ozonized corn[J].Food Control, 2014, 37:171-176.

[11] HOGBERG A, LINDBERG J E.Influence of cereal non-starch polysaccharides on digestionsite and gut environment in growing pigs[J]. Livest Prod Sci, 2004，87(2/3):121-130.

[12] 王建峰, 乐国伟. 小肽在动物营养中的应用[J]. 饲料工业, 2006(7): 9-11.

[13] 刘国华, 郑爱娟, 陈桂兰, 等. 不同蛋白饲料在肉仔鸡消化道中释放小分子肽的特性[J]. 饲料与畜牧, 2007(3):13-16.

[14] 张京, 戴兆来, 朱伟云. 肠道必需氨基酸代谢及其功能的研究进展[J].肠外与肠内营养, 2010,17(1): 55-59.

Effect of biotechnology treatment on feeding quality of peanut meal

HOU Debao1,2,3, CAI Guolin1,3,ZHU Dewei1,3,WU Dianhui1,3,LU Jian1,2,3

(1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University,Wuxi 214122, Jiangsu, China; 2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education,Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China; 3. School of Biotechnology, Jiangnan University,Wuxi 214122, Jiangsu, China)

Peanut meal has defects of aflatoxin B1(AFB1) easy to exceed standard, high content of non-starch polysaccharides(NSP), poor quality of protein, etc. Peanut meal was treated by microbial(Bacillussubtilis,SaccharomycescerevisiaeandPediococcusacidilactici) fermentation combined with complex enzyme. The feeding quality of peanut meal was improved. The results showed that after treatment the removal rate of AFB1in peanut meal was 94.6%, NSP content decreased from 30% to 10.5%, protein content increased from 47.8% to 61.5% and macromolecular protein obviously degraded into small molecule protein. The small peptide content increased from 5.36% to 25.21% and the total content of essential amino acid was improved by 19.67%. Additionally, the content of lactic acid increased from 0.7% to 2.8%. The quality of peanut meal was greatly improved by biotechnology treatment.

peanut meal; mixed fermentation; aflatoxin B1; non-starch polysaccharides

2016-10-19;

2017-02-21

国家973计划(2013CB733602)；江苏省普通高校研究生实践创新计划项目(SJLX5-0545)；山东省自主创新及成果转化专项(2014XGA06056)；江苏高校优势学科建设工程资助项目

侯德宝(1991)，男，硕士研究生，研究方向为饲料原料的生物技术处理(E-mail)517470343@qq.com。

陆 健，教授，博士生导师(E-mail)jlu@jiangnan.edu.cn。

TS201.3; TQ92

A

1003-7969(2017)06-0093-04