利用Barnase和Barstar基因创建棉花雄性不育系及恢复系

朱永红，李朋波，潘转霞，杨六六，夏芝，曹彩荣，吴翠翠，丁霄，侯保国

（山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000）

利用Barnase和Barstar基因创建棉花雄性不育系及恢复系

朱永红，李朋波，潘转霞，杨六六，夏芝，曹彩荣，吴翠翠，丁霄，侯保国

（山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000）

将Barnase及Barstar基因构建的不育及恢复基因载体，利用农杆菌介导法转入棉花基因组，经田间生物学检测及分子检测，获得120株T0阳性棉花不育系植株和76株T0阳性棉花恢复系植株。经回交转育，选育成不同性状的不育系材料5个，恢复性良好的恢复系材料3个；获得的不育系及恢复系材料已选育至T5。

棉花；杂种优势；雄性不育系；恢复系

棉花三系杂交品种较之常规品种具有产量高、纤维品质优等优势，而目前我国三系杂交棉育种由于受种质材料限制，进展缓慢，三系杂交棉花品种商业化推广应用非常有限。利用基因工程创建棉花雄性不育系及恢复系是一种有效的棉花三系杂交育种方法。国内外研究者先后利用核糖核酸酶Barnase基因获得了雄性不育的烟草和油菜、水稻、玉米、西瓜等植株[1-6]。山西省农业科学院棉花研究所利用Barnase及Barstar基因获得了雄性不育和恢复系植株。经回交转育，培育成不同特点的不育系材料5个，恢复系材料3个[7-10]。

1 棉花雄性不育基因及恢复基因载体构建

利用烟草中分离的花药绒毡层特异性启动子TA29、拟南芥中分离的启动子A6和A9与Barnase基因及Barstar基因构建转化载体，以新霉素磷酸转移酶基因II（NPTII）为报告基因、抗除草剂溴苯腈基因（Bxn）作为鉴定筛选基因[11-15]，经质粒DNA提取、纯化、酶切和连接等操作完成。载体命名为pBin19-3pBN，其获得国家发明专利（专利号为ZL 00124829.4）。

2 Barnase和Barstar基因对棉花的遗传转化结果

利用农杆菌介导法对棉花进行遗传转化，农杆菌选用根癌农杆菌EHA105，转化受体棉花品种为晋棉7号、珂字312和冀合321。采用山西省农科院棉花研究所创建的棉花高效转化再生技术体系，以下胚轴为外植体，经浸染、愈伤组织诱导、分化及植株再生几个阶段获得再生植株。再生植株采用嫁接方式移入大田，成活率高达95%以上[16-19]。

3 转基因不育及恢复植株的检测结果

用5×10-5mol/L的溴苯腈溶液涂抹待测棉花植株叶片，叶片颜色无变化的为转基因阳性植株，叶片表现出失绿枯黄的为非转基因棉花植株[11-12]。用PCR法分子检测进一步验证，引物用PADDON等报道的序列[20-22]，用于Barnase基因检测的引物有2条：P1为5′-CGGGTACCATGGCACAGGTTATCA AC-3′，P2为5′-TCTAGAGCTCGAGTTATCTGATCT TTGTAAAGG-3′。结果显示，转基因植株中检测到目的条带，而非转基因植株中没有检测到目的条带。以Barnase和Barstar DNA为探针，进行Southern杂交，结果显示，其与PCR检测结果一致。经检测，共获得阳性T0不育系植株120株，恢复系植株76株。

4 转基因棉花雄性不育系的花器特征及遗传规律

转基因阳性不育株T0能正常开花，开花时间较早；花朵较小，花药比正常棉花小、几乎无花粉。转基因阳性T0几乎全表现不育，人工授粉后能正常成铃结实，结实率与正常棉花无差异。从T1开始，不育株育性开始出现分离。T1不育株率变化范围较大，可能是因为Barnase基因的表达能力、表达环境不同，与Barnase基因插入位点数目也有关[23-25]。随选育世代延续，不育性状逐渐稳定。目前，获得不育性状能稳定遗传的材料有3个，对这些稳定的不育系材料进行回交转育，选用不同回交亲本，育成了抗虫不育系材料、具有海岛棉遗传背景的抗逆不育材料、抗旱不育系材料、优良纤维品质不育系材料及抗草甘膦除草剂不育系，已稳定遗传至T5。

5 恢复系的遗传选育及恢复度测定结果

恢复系鉴定采用分子检测结合田间溴苯腈检测及恢复性测试检测。采用回交选育方法，现已选育成不同遗传背景的恢复系材料3个。恢复度检测试验结果表明，恢复系恢复能力较强，恢复度在75%～92.6%，恢复性可稳定遗传，已选育至T5。遗传背景相近的不育系与恢复系之间恢复率较高。

6 展望

目前，棉花三系杂交品种选育受到不育系遗传基础较窄、恢复系农艺性状差等因素的限制，而利用基因工程创造雄性不育系及恢复系能够弥补目前棉花三系杂交棉育种存在的不足。随研究的深入，用Barnase基因创造雄性不育系已经在越来越多的植物中取得重要研究进展[26-27]。目前，由于遗传转化效率、基因表达、育性分离等原因，尚未取得商业化进展。由于基因工程雄性不育棉花的雄性不育性具有细胞核基因的特性，导致其育性在后代出现分离，应用受到限制[28-29]。值得欣慰的是，所获得的不育系棉花在人工授粉情况下具有正常的成铃结籽能力，其不育性也能稳定遗传，恢复系经多代选育，恢复能力已能够满足杂交制种要求，其恢复性能也可稳定遗传，目前我们培育的5种类型不育系及3个恢复系材料，拓宽了棉花雄性不育系及恢复系的遗传基础，已经组配选育出一些有苗头的杂交组合，为进一步培育棉花三系杂交品种奠定了基础。

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Study on Establishment Male Sterile Lines and Restorer Lines of Cotton by Using Barnase and Barstar Gene

ZHUYonghong，LI Pengbo，PANZhuanxia，YANGLiuliu，XIAZhi，CAOCairong，WUCuicui，DINGXiao，HOUBaoguo
（Institute ofCotton，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Yuncheng 044000，China）

A carrier constructed with sterile gene Barnase and its antagonist gene Barstar was transferred into cotton genome mediated by Agrobacterium.It was verified through molecular detection that 120 positive male sterile lines of cotton plants of T0generation and 76 positive restorer lines of cotton plants of T0generation were got.By backcrossing,5 male sterile lines of cotton of different traits and 3 restorer lines ofcotton with good ability ofrecovery were bred.

cotton;heterosis;male sterile line;restorer line

S562

：A

：1002-2481（2017）07-1056-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.07.02

2017-03-01

国家重点研发计划项目（2016YFD0101416）

朱永红（1974-），男，陕西渭南人，助理研究员，硕士，主要从事棉花遗传育种研究工作。