番鸭基因多态性与羽毛相关性分析

董飚 秦豪荣 徐琪 李晓鸣 纪荣超 王健

摘要：为探讨黑素皮质素受体1（melanocortin-1 receptor，简称MC1R）基因对番鸭羽色的影响，采用PCR和直接测序法对番鸭[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因编码区进行多态性分析，比较不同羽色番鸭群体遗传参数和基因型分布卡方检验。结果表明：在番鸭[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因编码区发现G274A、G279A、C485A突变，使第92处氨基酸由谷氨酸（E）变为赖氨酸（K），第162处的氨基酸由苏氨酸（T）变为天冬氨酸（N）。通过各个位点不同羽色番鸭群体基因型、等位基因频率的比较分析，同时结合不同群体间基因型分布卡方检测，发现在第279处的G-A突变中白羽番鸭仅有GG型，而其他3个携带大量黑羽的番鸭群体都以GA、AA型存在；同时全白番鸭与其他3个番鸭群体之间卡方值最大，推测此位点对番鸭的羽色影响较大。而从其他2个突变位点的数据分析推测，它们对番鸭的羽色几乎没有影响。研究结果为开展番鸭羽色研究和育种工作奠定了基础。

关键词：番鸭；[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因；羽色；多态性；相关性分析

中图分类号： S834+.892 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0024-03[HS）][HT9.SS]

番鸭是优良的肉鸭品种，原产于南美洲和中美洲的热带地区，具有生长速度快、瘦肉率高等特点。在我国番鸭已有200多年的养殖历史，开始以农户散养所占比例较大，现在已逐渐形成规模化养殖。除了纯白羽番鸭外，国内还有很多黑羽番鸭，白羽和黑羽交叉存在，有些有规律，如有些黑羽番鸭仅在头或翅膀部位存在白羽，其他部位均为黑羽，有些几乎全为黑羽。通过常规的育种手段想选育成全黑羽番鸭是很难的，随着分子生物学技术的发展，功能基因的作用机理也逐渐被挖掘。研究表明，禽类羽色是个多基因控制的性状，遗传复杂，基因间有显隐性、互作、上位等关系，要想准确控制番鸭的羽色是一个比较大的难题。

黑素皮质素受体1（melanocortin-1 receptor，简称MC1R）基因的编码区只含有1个外显子，不同动物可编码氨基酸的数量不同，一般长度为310个，是最小的G蛋白耦合受体，具有7个跨膜结构域[1]。它通过与内源配体促黑激素结合来促进腺苷酸环化酶的活化，提高环腺苷酸水平，激发酪氨酸酶水平的提高，导致黑色素的形成，实现对动物肤色、毛色或羽色的调控[2-3]。目前已知一些[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因变异可引起动物黑色素形成的变化以及毛色/羽色的变异，师科荣等通过分析我国11个地方猪种和3个国外引入猪种的[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因多态性，发现仅从[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因上发生的突变看，我国地方猪种的毛色与引入猪种毛色分属截然不同的遗传体系，我国地方猪种的毛色属于显性黑毛色体系，而且该基因对我国地方猪种毛色的差异没有起到关键的影响作用[4]。Deng等发现[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因一个突变位点与我国地方猪种的黑毛色有关[5]。唐贺等分析了3个地方黄牛群体和1个引进品种的[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因编码区的变异情况发现，该基因E座位对牛的毛色有重要影响，E+和ED等位基因与黑色表型有关，而e等位基因与红色表型有关，但黄色、棕色和红色表型还与其他座位基因相关联[6]。杨永升等以丝羽乌骨鸡与明星肉鸡为亲本建立的资源家系群体鸡来检测[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因编码区的多态性，结果发现，这些突变位点与鸡的肤色、胫色、肉色等性状有关，推测[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因可能是鸡黑色素性状的主效基因或者与鸡控制黑色素性状的主效基因连锁[7]。[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因A356G处的突变是控制他留乌骨鸡羽色的一个关键变异位点[8]。另外，还有很多关于动物[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因突变的报道，但是没有与毛色/羽色进行相关分析，或者有些突变与动物毛色/羽色无关。

在此基础上，本试验拟运用PCR和直接测序技术检测不同羽色番鸭[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因的突变位点，分析不同羽色番鸭群体[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因的基因型频率、等位基因频率以及遗传参数等数据，为番鸭羽色研究提供参考。

1材料与方法

1.1试验动物

分别采集全黑（简称QH，指所有羽毛几乎为黑色，部分会在翅膀部位出现1～2根白羽）、白翅（简称BC，翅膀一半以上为白色，其他部位几乎为黑色）、白头（简称BT，头部羽毛为白色，夹杂少量黑羽，其他部位均为黑色）和全白（簡称QB，全身白羽）番鸭血样各60个，用肝素钠抗凝，离心留取血红细胞，用常规酚/氯仿抽提法提取番鸭基因组DNA，并溶于蒸馏水中，用核酸浓度测定仪检测其浓度和纯度，然后稀释成50～100 ng/μL备用。

1.2引物设计[JP+1]

根据GenBank中公布的鸭[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因序列（EU877264）设计了1对引物P1，P1上游序列为F：5′-CGACGTGCCCAACGAAC-3′，下游序列为R：5′-CTGGCTCCGGAAGGCATAGAT-3′，扩增产物长度为793 bp，退火温度为58 ℃。[JP]

1.3PCR扩增反应

PCR反应体积为25 μL，10×PCR buffer（Mg2+ 15 mmol/L） 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、10 pmol/L上下游引物各1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL，加蒸馏水补足至25 μL。

1.4测序

扩增产物用琼脂糖凝胶进行检测，对符合预期结果的PCR产物进行胶纯化回收，将纯化产物直接送公司测序，将不同个体的测序结果用DNAMAN软件进行比较，即可获得[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因在番鸭群体中存在的差异。

[HTK]1.5数据处理[HT]

运用遗传学统计公式计算基因型频率、等位基因频率、纯合度、杂合度和多态信息含量，并分析基因型在不同羽色番鸭群体中分布的差异性。

2结果与分析

2.1测序和基因型识别

将不同个体测序结果进行比较发现，在扩增的片段中存在3个突变位点，分别为编码区第274、279、485处的G-A、G-A和C-A突变（图1箭头标记处），其中第274处突变导致氨基酸由谷氨酸（E）变为赖氨酸（K），第485处突变导致氨基酸由苏氨酸（T）变为天冬氨酸（N），第279处的突变没有引起氨基酸序列发生变化。[FL）]

基因第274处G-A突变形成了GG、GA、AA型，全黑番鸭群体以GA、AA型为主，白翅番鸭以AA型为主，白头番鸭以GG型为主，全白番鸭3种基因型较为接近。全黑和白翅番鸭群体中以A等位基因为主，白翅番鸭群体中几乎均为A等位基因，白头番鸭群体以G等位基因为主，全白番鸭群体2个等位基因频率较为接近。在4个番鸭群体中，全白番鸭的杂合度和多态信息含量最高，分别为0.499 4、0.374 7；全黑番鸭群体杂合度为0.383 2，多态信息含量为0309 8；白翅和白头番鸭群体杂合度和多态信息含量较低（表2.3G279A位点遗传信息分析

基因第279处G-A突变形成了GG、GA、AA型，全白番鸭群体只存在GG型，其他3种番鸭群体均只存在GA型、AA型，白翅、白头番鸭群体以AA型为主，全黑番鸭群体GA型和AA型较为接近。全黑、白翅和白头番鸭群体均以A等位基因频率为主，其中白翅番鸭A等位基因频率最高。4个番鸭群体中，全黑的杂合度和多态信息含量最高，白头番鸭群体次之（表3）。

由表4可知，4个番鸭群体之间基因型分布存在极显著差异，其中以白头番鸭和白翅番鸭之间差异最小，全白番鸭和其他3个羽色番鸭的差异最大。

2.4G485A位点遗传信息分析

基因第485处C-A突变形成了CC、CA、AA型，4个番鸭群体均以CC型为主，白翅番鸭群体只有CC型，全黑和白头番鸭群体只有CC型和CA型。所有群体中，均以C等位基因频率为主。全白番鸭群体杂合度和多态信息含量最高，分别为0.420 0、0.331 8，白头番鸭群体次之（表5）。

由表6可知，4个番鸭群体之间基因型分布存在显著差异，[JP3]部分群体之间基因型分布存在極显著差异，其中以白翅番鸭和全黑番鸭之间差异最小，白翅番鸭和全白番鸭之间差异最大。[JP]

识别位点，该位点为同义突变，通过分析发现，A399G位点与羽色没有显著性相关，但是番鸭基因型全为AA型，家鸭的基因型全为GG型，半番鸭几乎均为AG型，从而推断该位点可以有效鉴定和区分家鸭、白番鸭和半番鸭3类鸭群体[9-10]。本研究通过PCR、测序方法检测了[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因在不同羽色番鸭群体中存在单核苷酸突变情况，通过序列比对，在编码区发现3处突变，分别位于第274、279、485处的G-A、G-A、C-A 突变，第274处和第485处的突变使得这2处的氨基酸序列发生了变化，分别为谷氨酸（E）变为赖氨酸（K）和苏氨酸（T）变为天冬氨酸（N），这与夏波报道的在此区间发现的9个多态位点[11]相比要少一些，而且部分位点突变还不一样，这可能与试验所用的番鸭群体不同而存在差异。

为了解这些突变是否与番鸭羽色有关，本研究还分析了不同羽色番鸭各个突变位点的基因型频率和基因型分布卡方检验。在第274处的G-A突变位点，全黑和白翅番鸭中不存在GG型，而白头番鸭几乎都是GG型，全白番鸭3个基因型频率差不多。4个群体不同基因型分布卡方检验，虽然不同群体之间基因型分布存在极显著差异，但是白头番鸭与全黑番鸭、白翅番鸭的卡方检验值较大，全白番鸭与其他3个群体的卡方检验值次之，推测此位点对羽色影响不大，这与夏波报道的结果不同，他认为该位点与番鸭羽毛颜色差异有关，这可能与试验番鸭群体所用样品量（2羽白羽番鸭、2羽黑羽番鸭）较少有关[11]。在第279处的G-A突变位点，3个携带了黑羽的番鸭群体都以GA、AA型存在，而全白番鸭以GG型存在，结合不同番鸭群体之间基因型分布卡方检验值，全白番鸭与其他3个番鸭群体之间卡方值最大，推测此位点对番鸭的羽色影响较大。在第485处的C-A突变位点，白翅番鸭以CC型存在，全黑番鸭和白头番鸭以CC型和CA型存在，全白番鸭3种基因型都存在，所有群体都以CC型频率最高，结合不同群体番鸭基因型分布卡方检验，4个番鸭群体之间基因型分布卡方检验值差异与羽色没有明显关系，推测此位点对羽色影响不大。由此可以推测，[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因的突变位点不一定都会影响番鸭的羽毛颜色。

纯合度、杂合度、多态性信息含量（polymorphic information content，简称PIC）是群体遗传参数分析常用数据，其中杂合度和PIC可用来衡量基因多态性丰富程度和群体遗传变异水平的高低。本试验所用4个群体在不同突变位点其杂合度和PIC差异较大，这与每个位点的基因型种类和杂合子的比例有关。如果群体基因型种类单一，杂合子的比例少，则群体的杂合度、PIC就偏低。通过杂合度和PIC分析可知，群体在某个突变位点的遗传变异程度，如果杂合度和PIC值都偏大，则说明群体保持了良好的遗传信息，可选择的范围广泛；反之，则遗传信息小，可选择的范围也比较窄。

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