西藏野生甜荞碳酸酐酶基因的克隆和生物信息学分析

侯维海+王建林+旦巴+胡单

摘要：依据已公布的荞麦转录组测序信息，从Contig文库中获得了1个碳酸酐酶（carbonic anhydrase，简称CA）转录本，通过逆转录PCR（RT-PCR）扩增得到CA基因全长序列。生物信息学分析表明，基因全长1 233 bp，开放阅读框978 bp，编码325个氨基酸；分子量35.11 ku，等电点7.59；包含9个α-螺旋、6个β-折叠、多个无规则卷曲和延伸链；含有1个信号肽和1个跨膜区；具有β-类碳酸酐酶典型的2个氨基酸保守域。亚细胞定位显示，该蛋白出现在叶绿体中的可能性最大。利用同源建模法构建了FsCA1三维结构模型，表明甜荞CA与豌豆CA同型八聚体能很好地匹配，推测甜荞CA也是同型八聚体。用实时荧光定量PCR检测在荞麦不同器官中的表达水平，结果显示，[WTBX][STBX]FsCA1[WTBZ][STBZ] 在叶中表达水平最高，其次是在茎中，在根中表达水平最低。

关键词：西藏甜荞；碳酸酐酶；基因；三维结构预测；生物信息学

中图分类号： S188文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0020-04[HS）][HT9.SS]

碳酸酐酶（carbonic anhydrase，简称CA，EC4.2.1.1）是一类含锌的金属酶，广泛存在于动物、植物等有机体的组织和器官中[1]。植物中CAs至少包括5个基因家族（α、β、γ、δ和ε），主要分布在绿色组织中，可逆地催化CO2的水合反应，产生HCO-3和H+，参与植物光合CO2的固定、CO2转运、呼吸作用、离子交换等生理过程[2-3]。CA能加快CO2在细胞内的水合速度，有助于CO2运输到活跃的光合细胞中，从而提高光合速率；同时，CA活性随着叶绿素含量、锌含量增加而增强，具有明显提高光合作用的能力，在一定程度上CA活性与光合作用呈正相关[4-6]。近年来，前人对植物CA的研究主要涉及生理生化作用和酶学特性，而对编码该酶基因的组成、结构和功能等尚未形成统一认识；现有研究仅限于少数几种植物，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）[4，7]、黄顶菊（Flaveria）[8]、玉米（Zea mays）[2]、龙眼（Dimocarpus longan Lour）[9]等，尚未见关于荞麦CA基因克隆和表达分析的报道。在高等植物中CA主要有3类，即α-CA、β-CA和γ-CA，各种类型之间氨基酸序列保守性较低，同时每个亚基因家族又包含多个成员，其成员亚细胞定位有较大差异。例如，拟南芥β-CA基因家族有6个成员（[WTBX][STBX]β-CA1～β-CA6），其中β-CA1、β-CA5定位于叶绿体中，β-CA2、β-CA3、β-CA4定位于细胞质中，β-CA6[WTBZ][STBZ]定位于线粒体中[4-5，10-11]；在黄顶菊属（Flaveria）中，C3类F. pringlei、C4类F. bidentis的叶片中均分离到3个不同的[WTBX][STBX]β-CA单体（βCA1～βCA3[WTBZ][STBZ]），这些成员基因之间的序列相似性或保守性超过90%。CA基因的功能验证在模式植物拟南芥上已取得进展，以β-CA基因家族的研究较为深入。有研究发现，[WTBX][STBX]Atβ-CA1[WTBZ][STBZ]编码蛋白可发生巯基亚硝酸化，降低与水杨酸结合的能力，进而影响CA活性，其表达丰度与拟南芥幼苗存活率相关[12-13]；同时Atβ-CA1、Atβ-CA4参与调控保卫细胞气孔运动，是保卫细胞气孔运动的上游调节因子[14]。但是，关于其他β-CA的功能目前还不清楚[10]。总体而言，在C3植物中，β-CA主要分布在叶绿体叶肉细胞的基质中[7]，可能参与协助CO2从叶绿体被膜扩散或者催化HCO-3快速脱水形成CO2；质粒中也存在β-CA，可能与气孔的关闭、脂类合成和抗病性有关[12，15-17]。

甜荞属蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum），是一种重要的杂粮兼药用植物。随着市场上对荞麦需求量的增加，蕎麦育种研究显得愈发重要。荞麦起源于西藏地区，该区是世界荞麦的起源中心之一[18]，属于低纬度高海拔农业区，具有全球最典型的立体生境，其地质独特，地形地貌复杂，土壤种类繁多，生态环境千差万别，产生了丰富的荞麦变异类型，具有区域独特的荞麦种质。本研究拟以西藏林芝市郊区野生甜荞为材料，根据已公布的甜荞转录组Contig文库中筛选出的碳酸酐酶转录本信息，设计CA基因的特异引物，通过逆转录PCR（RT-PCR）获得荞麦CA基因全长序列，并进行生物学信息分析，初步明确荞麦CA基因的结构和表达特点，为荞麦抗逆品种的选育提供依据。

1材料与方法

1.1材料及其总RNA提取

甜荞种子于2013年10月在西藏林芝市章麦村（地理位置29°50′N、93°25′E，海拔3 000 m）野外收集，次年4月初，将收集的野生甜荞种子散播种植于西藏大学农牧学院试验田内，除人工除草、浇水外，均在自然条件下生长。在荞麦5叶期，选取5株健壮植株的幼嫩叶片，作为提取RNA的试验材料。选取材料均设3次重复，用清水冲洗5～8次，然后再用吸水纸轻轻吸去水分，立刻置于液氮中速冻，-80 ℃保存备用。[JP]

取新鲜幼叶3.0 g，在液氮保护中快速研磨成粉末状，然后按照TRIzol试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）说明书介绍的方法提取总RNA，用DNaseⅠ去除RNA中的痕量DNA。用1%琼脂糖凝胶检测总RNA的完整性，紫外分光光度计分析其浓度、纯度。

1.2基因全长序列的克隆

测序结果经NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行BLAST比对和开放阅读框（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析，用DNAMAN软件进行同源核苷酸和氨基酸序列多重比对分析，确定克隆序列为[WTBX][STBX]β-CA1[WTBZ][STBZ]。利用在线工具ExPASy Proteomics Server（http：//www.expasy.org）预测编码蛋白质的理化性质，用Psipred Server、SWISS-MODEL （http：//swissmodel.expasy.org）分别对编码蛋白二级结构进行预测和三级结构建模。用Scan Prosite（http：//prosite.expasy.org/scanprosite）在线工具预测FsCA1编码蛋白的motif保守序列，并用Signal P4.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）预测蛋白定位信号。用WOLF PSORT （http：//wolfpsort.org）对FsCA1进行亚细胞定位，用TMHMM Server v. 2.0软件（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）预测跨膜区。用Clustalx、MEGA5.1[JP]构建邻接（Neighbor-Joining）系统发生树。

1.4荞麦不同器官中实时定量PCR分析

在荞麦开花期，选取叶片、主茎和主根作为试验材料，按照“1.2”节的cDNA第1链合成法分别获得叶片、主茎和主根cDNA第1链，将3种器官的cDNA溶液按倍比稀释成相同浓度，再按SYBR premix Ex TaqⅡ试剂盒说明书操作方法，在CFX-96 PCR仪（Bio-Rad）上进行qRT-RCR反应，每个样品至少重复3次。反应体系20 μL，含10 μL 2×PrimeScript buffer，各1 μL 10 μmol上、下游引物，10 ng cDNA模板。PCR反应程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 15 s，退火温度56～95 ℃，每个循环增加0.5 ℃，持续20 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。延伸阶段搜集信号，持续0.05 s获得解链温度，采集熔解曲线荧光信号。程序运行结束后，系统自带的CFX管理软件根据设定的参数给出结果。qRT-RCR扩增片段长度均为150 bp。以三磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）为内参基因（表1），以叶片中的表达量为对照。

2结果与分析

[HTK]2.1全长基因的获得[HT]

测序结果表明，目的基因长1 233 bp，是正确的CA基因序列。ORF finder预测发现，该序列具有完整的开放阅读框（ORF），长度为978 bp，编码325个氨基酸残基，详见图1。

2.2编码蛋白的理化性质和高级结构预测

预测FsCA1的分子式为C1 574H2 484N412O470S13，分子量 35.11 ku；正电残基（Arg+Lys）、负电残基（Asp+Glu）分别为34、33个，等电点7.59；不稳定指数为50.78，表明该蛋白不稳定；脂肪系数89.75；亲水性系数0.023。

预测FsCA1蛋白的二级结构主要有4种类型，由9个α-螺旋、6个β-折叠、多个延伸链和无规则卷曲组成。利用SWISS MODEL蛋白质在线建模工具Alignment Model，以荞麦FsCA1为目标序列，以同源性高达82.38%的豌豆CA蛋白三维结构（POB：1ekj.1.B）为模板进行同源建模，建模残基范围116～325个，目标序列和模板蛋白序列相似性达到56%。豌豆CA蛋白为同型八聚体，而FsCA1蛋白三维结构具有丰富的α-螺旋、无规则卷曲，因此推测本研究获得的编码产物也是同型八聚体（图2）。

编码蛋白信号肽、亚细胞定位和跨膜区的预测

Signal P4.0软件预测表明，FsAC1的第1～25位氨基酸残基间有1个信号肽。用WoLF PSORT预测表明，该蛋白在叶绿体的定位系数为12.0（chlo：12），在线粒体的定位系数为2.0 （mito：2.0），在其他细胞器官中无分布。据此判断，[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]编码蛋白最有可能在叶绿体、线粒体内发挥作用，或附着在这些细胞器上共同完成。HMMTOP分析结果显示，第192～214位氨基酸之间有23个氨基酸形成的跨膜区。

编码蛋白的motif分析

β-碳酸酐酶具有2个典型的保守区，保守区H1：C-[SA]-D-S-R-[LIVM]-x-[AP]，保守序列L2[EQ]-[JP3][YF]-A-[LIVM]-x（2）-[LIVM]-x（4）-[LIVMF]（3）-x-G-H-x（2）-C-G。FsAC1序列完全与此符合，其中保守区H（第156～163位）的保守序列为CSDSRVcP，保守区F（第200～220位）的保守序列为EYAVlhLkvsnIVViGHsaCG。[JP]

2.5不同物种[WTBX][STBX]AC1[WTBZ][STBZ]基因及其编码蛋白的序列同源比对

以[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]基因序列为探针，通过BLASTn同源对比，发现9条与[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]基因相似度较高的序列，分别为大豆（Glycine max）GmCA（XM_003553786.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）[WTBX][STBX]AtCA1[WTBZ][STBZ]（NM_111016.3）、豇豆（Vigna unguiculata）VuCA（JQ429799）、黄百合（Flaveria brownii）FbCA（FBU08402）、绿豆（[WTBX][STBX]Vigna radiata）VrCA1[WTBZ][STBZ]（AF139464.2）、豌豆（Pisum sativum）PsCA（M63627.1）、线叶黄顶菊（Flaveria linearis）FICA1[JP3]（FLU19738）、甘蓝（Brassica oleracea）BoCA1（XM_003553786.1）、[JP]甘蓝型油菜（Brassica napus）BnCA（GQ36780）、鹰嘴豆（Cicer atietinum）CaCA（XM_004489219.1）、煙草（Nicotiana tabacum）NtCA（AF4479.2）、蓖麻（Ricinus communis）RcCA（XM_002524596.1）、亚洲棉（Gossypium arboreum）GaCA（KHG255181）、亚麻荠（Camelina sativa）CaCA1（XP_010496563）、日中花（[WTBX][STBX]Mesembryanthemum nodiflorum）MnCA1[WTBZ][STBZ]（JN228098.1）、川桑（Morus notabilis）MnCA（XM_010110474）、龙眼（Dimocarpus longan）DlCA（JN033201）、欧洲与美洲山杨杂种（Populus tremula×Populus tremuloides）PtCA（PTU838）、胡杨（Populus euphratica）PeCA2（XM_011049011）、富贵草（Pachysandra terminalis）PtCA（DQ781308.1）、银合欢（Leucaena leucocephala）LICA（KC92476.1）、菠菜（Spinacia）SpCA（J05403.1）和葡萄（[WTBX][STBX]Vitis vinifera）VvCA1[WTBZ][STBZ]（XM_002277921.3）。利用ClustalX、MEGA5.1软件，构建[WTBX][STBX]FsCA1和其他物种CA1[WTBZ][STBZ]编码蛋白的系统进化树，可见5种豆科植物CA1蛋白序列相似度较高，明显聚为一类，除苋科藜亚科的菠菜、番杏科的日中花[WTBX][STBX]AC1[WTBZ][STBZ]序列有一定相似度外，其他物种均单独成类（图3）。[FL）]

3讨论

碳酸酐酶（CA）普遍存在于绿色植物中，但物种间CA活

性差别很大。本试验对荞麦CA基因进行全长克隆和序列分析，通过生物信息学分析、多物种同源序列比对，初步明确了[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]基因编码蛋白的基本特性、高级结构。亚细胞定位和跨膜区预测发现，FsCA1主要定位于叶绿体中，少量分布于线粒体中；组织特异性表达分析印证了上述结果，表明β-CA主要分布在叶绿体叶肉细胞的基质中[16]。在荞麦绿色组织中的表达丰度显著高于在非绿色组织中，暗示FsCA1可能与光合作用有关。编码蛋白motif预测发现2个保守序列，具有β-CA典型结构特征，进一步证明编码蛋白是β-CA，似乎也支持FsCA1可能在光合作用中发挥功能的推测。这些结果为深入研究[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]基因奠定了基础。

不同物种[WTBX][STBX]AC1[WTBZ][STBZ]基因序列比对结果显示，荞麦与菠菜的同源性（64%）略高于豌豆（61%），远高于日中花（58%）。有趣的是，根据蛋白序列比对生成的进化树却显示，荞麦FsAC1却与MnCA关系最近，其次是菠菜，而与豌豆的进化距离较远。分析蛋白序列发现，荞麦与日中花存在1段完全相同的序列（FMVFACSDSRVCPSHVLDFQPGEAFVVRNIANMVP），与菠菜的片段仅差异1个氨基酸（CEKEAVNVSLGHLLTYPFVRDGLVKKTLALKGGYYDFI），而与豌豆在2段蛋白片段上都有差异，分别相差1、2个氨基酸。这种同源基因保守序列上的差异可能反映物种的亲缘关系，也可能与蛋白官能团有关，但与预测的motif保守序列存在异议，还须进一步论证。根据现有结果推测，荞麦CA可能由上述2个官能团决定功能，FsCA1在功能上可能更接近MnCA。本研究建立[WTBX][STBX]FSCA1[WTBZ][STBZ]编码蛋白的三维结构时，是以已知的同源豌豆CA（POB：1ekj.1.B）为模板的，这可能会带来误差，但是POB数据库现存的模板数量有限，未发现与荞麦CA功能最接近物种的模板，因此，FSCA1三维结构还需进一步完善。

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