结直肠癌中微卫星不稳定性与PD-L1表达的关系及临床意义

2017-07-21 03:49冯稳吴新新郭永军常玉喜夏庆欣
中国肿瘤临床 2017年12期
关键词:微卫星组织化学阳性率

冯稳 吴新新 郭永军 常玉喜 夏庆欣

·临床研究与应用·

结直肠癌中微卫星不稳定性与PD-L1表达的关系及临床意义

冯稳①吴新新②郭永军②常玉喜②夏庆欣①

目的:研究PD-L1在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中的表达及临床意义。方法:选取2015年1月至2016年1月在郑州大学附属肿瘤医院接受CRC根治性手术的患者210例,分为微卫星高度不稳定(high-frequency microsatellite instability,MSI-H)、微卫星低度不稳定(low-frequency microsatellite instability,MSI-L)、微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)3个组,采用免疫组织化学法检测各组织标本中细胞程序性死亡配体1(Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)的表达,分析PD-L1在各型CRC中的表达特点。结果:PD-L1在低分化CRC中的表达高于中、高分化CRC(P<0.05),PD-L1在MSI-H的CRC中阳性率为75.8%,在MSIL/MSS中的阳性率为9.3%,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:PD-L1在部分CRC癌组织中阳性表达,尤其是在MSIH的CRC阳性率显著高于MSI-L及MSS的CRC。PD-L1阻断剂对MSI-H的CRC患者疗效可能更好。

PD-L1 结直肠癌 免疫组织化学 临床意义

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一,目前其发病率居全球所有恶性肿瘤的第3位,在中国的发病率也呈逐步上升趋势[1-2]。除了传统的手术和放化疗,近年来分子靶向治疗在特定患者人群中表现出显著的疗效。细胞程序性死亡配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)能够抑制T细胞的活化与增殖,诱导T细胞凋亡,从而维持机体的免疫平衡,避免自身的免疫损伤[3-4]。PD-L1抗体可用于治疗多种恶性肿瘤如非小细胞肺癌、卵巢癌等[4-6]。本研究探讨PD-L1在CRC中的表达及临床意义,以期为PD-L1在结直肠癌个体化精准治疗的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 收集2015年1月至2016年1月在郑州大学附属肿瘤医院接受CRC根治性手术的患者210例临床资料,手术前均未接受任何治疗,排除标准:遗传性腺瘤性息肉病及遗传性非息肉性结直肠癌患者。入组患者手术石蜡组织标本,包括210例肿瘤组织、50例癌旁正常组织(距离癌变组织边缘直径>5 cm,术后切缘病理未见肿瘤细胞)。本研究得到郑州大学附属肿瘤医院伦理委员会批准,患者及家属签署知情同意书。入组患者的基本资料:男性118例,女性92例;年龄31~85岁,平均年龄63.5岁;右半结肠(升结肠和右半横结肠)43例,左半结肠(左半横结肠,降结肠和乙状结肠)32例,直肠135例。病理分期标准按照美国癌症联合委员会(AJCC)/国际抗癌联盟(UICC)结直肠癌第7版TNM分期标准[7]。

1.1.2 取材和病理切片的制备 手术切除新鲜结直肠组织标本后送病理科,每例患者留取癌组织及癌旁组织标本各一块,以10%福尔马林固定溶液固定24 h以上,制备石蜡包块,制作连续切片厚度4 μm,分别常规以苏木素-伊红(HE)染色、PD-L1免疫组织化学染色,显微镜下观察并拍照。

1.2 方法

1.2.1 MSI的检测 本研究使用MSI检测试剂盒检测贝斯塔遗传标记(Bethesda Marker):Bat25、Bat26、D5S346、D2S123和D17S250共5个位点,正向引物标记荧光,对同一患者的肿瘤组织和正常黏膜组织的DNA进行PCR扩增,再用毛细管电泳检测扩增的产物,判断检测的肿瘤组织和正常黏膜组织是否存在微卫星不稳定性。5对引物来自美国国立生物技术信息中心(NCBI)基因库,上游引物5'端分别作3种不同颜色的荧光标记。相对分子量标准采用美国ABI公司的GS-500LIZ Size Standard内标。同色引物扩增产物长度有别,可同时对多个位点进行片段分析,引物序列见表1。

1.2.2 免疫组织化学染色法 切除的组织标本用甲醛溶液固定,石蜡包埋,组织切片的厚度为4 μm,将其置于玻璃片上,用二甲苯脱蜡,在梯度乙醇内水化,在900 W微波加热2 s,进行抗原修复后,于0.3%的H2O2液中浸泡30 min阻断内源性抗原,用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗3次,用10%正常的血清阻断背景非特异性的染色,加一抗置于湿盒内孵育过夜。一抗为兔抗人PD-L1单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司),1:100稀释。生物素包被的鼠抗兔抗体孵育30 min后使用PBS洗3次,再用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物孵育30 min,然后使用苏木素复染。以正常小鼠的IgG代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 免疫组织化学结果判读标准 本研究使用免疫组织化学SP法检测PD-L1在CRC癌组织中的表情况,参考杨军等[8]的免疫组织化学检测结果判读方法对结果进行判断统计。免疫组织化学切片由病理科医师判读,PD-L1定位于肿瘤细胞膜或细胞浆,当所观察指标定位部位出现棕黄色颗粒为阳性表达。直接计算阳性细胞数(或面积)占视野下或整张切片内同类细胞数(或面积)的百分比进行分级。阴性(0):无着色;弱阳性(+):任何比例的细胞呈现微弱、不完整膜着色;阳性(++):>10%的细胞呈现弱至中等强度、完整但不均匀膜棕黄着色;强阳性(+++):>30%的细胞呈现强、完整膜棕褐着色。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,定性资料分析方法主要使用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MSI在CRC中的检测结果

与正常结直肠黏膜对比,210例CRC癌组织标本中MSI-H的发生率为13.3%,MSI-L的发生率为0.9%,MSS的发生率为85.7%,其中28例MSI-H的CRC同时存在Bat26与Bat25的位点改变,10例存在D2S123位点的改变,11例存在D17S250位点的改变,4例存在D5S346位点的改变,只有2例5个位点均存在改变(表2)。

2.2 PD-L1在CRC癌组织与癌旁正常组织中的表达

PD-L1在CRC癌组织的阳性率为18.6%,对照组的50例癌旁正常黏膜PD-L1阳性率为6.0%,统计分析显示PD-L1在CRC中肿瘤组织的阳性率高于癌旁正常组织(P<0.05,表3,图1)。

表1 MSI引物及特征Table 1 MST primers and characteristics

表1 MSI引物及特征(续表1)Table 1 MSI primers and characteristics

表2 CRC的MSI检测结果Table 2 Detection of MSI in CRC

表3 PD-L1在CRC中肿瘤组织与癌旁组织中的表达Table 3 Expression of PD-L1 in cancer and paracancer tissues of CRC

2.3 PD-L1与CRC临床病理特征的相关性

分析显示PD-L1在CRC中的表达与性别、年龄、淋巴结转移、肿瘤部位、组织学类型、浸润深度和病理分期之间差异无统计学意义(P<0.05);仅在分化程度上差异具有统计学意义(表4,P<0.05)。

2.4 PD-L1在MSI-H的CRC和MSI-L/MSS的CRC中的表达情况

在MSI-H的CRC中,PD-L1阳性率为75.8%;在MSI-L/MSS的CRC中,PD-L1阳性率为9.3%,两组比较差异具有统计学意义(表5,P<0.05)。

图1 PD-L1在CRC癌组织与癌旁正常组织中的表达Figure 1 Expression of PD-L1 in cancer and paracancer tissues of CRC

表4 PD-L1与CRC的临床病理特征关系Table 4 Relationship of PD-L1 with clincopathological characteristics of CRC

表4 PD-L1与CRC的临床病理特征关系(续表4)Table 4 Relationship of PD-L1 with clincopathological characteristics of CRC

表5 PD-L1在MSI-CRC中的表达Table 5 Expression of PD-L1 in MSI-CRC

3 讨论

CRC是全球常见的消化道恶性肿瘤,与西方国家相比,CRC在中国的发病率相对较低,但是随着社会经济的发展、生活环境的改变、人民生活习惯的变化等,该病在国内的发病率逐年上升,且趋于年轻化[9]。因此,研究CRC的发病机制、治疗和预防,对降低CRC的发病具有重要的临床价值。近几年来,随着对肿瘤发病机制的研究不断深入,对癌基因和抑癌基因的进一步了解,CRC的治疗已经从外科治疗为主、放化疗为辅的综合治疗转向了精准化、个体化治疗理念,应运而生的生物治疗、基因治疗、免疫治疗越来越受到重视[10-13]。

本研究结果显示,PD-L1在癌组织与正常组织之间表达存在显著性差异,PD-L1在癌组织中均存在阳性表达率升高。PD-L1在CRC表达的临床病理特征仅与分化程度相比差异具有统计学意义(P<0.05)。

PD-L1在MSS的CRC中,PD-L1的阳性表达与MSS的CRC有无淋巴结转移无关(P>0.05),与病理分期无关(P>0.05),但PD-L1在分化程度低的MSS的CRC中阳性率显著高于中、高分化组(P<0.05)。

进一步分析发现PD-L1在MSS的CRC中阳性表达率为9.3%,而Droeser等[14]研究显示,PD-L1在MSS的CRC中表达率为37%,造成这种差异的原因,可能是入组病例数量过少,但在PD-L1表达与肿瘤的低分化,缺少淋巴结转移等临床病理特征与本研究相同,而对于病理分期早的特点在本研究中并未得出相同的结论。

PD-L1是细胞毒性免疫应答的关键抑制剂,肿瘤细胞上PD-L1的表达可以被免疫微环境诱导,导致肿瘤的免疫逃避以及预后不良。Llosa等[15]研究发现,在CRC的免疫微环境中富含活化的Th1、CTL(细胞毒性T淋巴细胞),在错配修复中存在缺陷,为了平衡这种活性Th1/CTL的微环境,MSI CRC选择性地上调某些免疫检查点的表达,其中就包括有PD-L1。Rosenbaum等[16]对结直肠癌的研究发现,PD-L1抑制反应与微卫星不稳定性相关。本研究中,MSI-H的CRC患者癌组织中PD-L1中呈高表达(PD-L1阳性为75.8%),与上述研究成果一致,同时进一步证实了Li等[17]的研究结果,即PD-L1与CRC患者的预后有关。虽然目前国内的相关研究较少,但是本研究结果为这一设想提供了理论依据,且相关的临床研究仍在继续开展中。

综上所述,本研究对PD-L1在结直肠癌中的表达进行了初步研究,证实PD-L1在部分CRC癌组织中阳性表达,尤其是在MSI-H的CRC患者中其阳性率显著高于MSI-L及MSS的CRC。根据本研究结果推论,在临床实践中,PD-L1阻断剂对MSI-H的CRC患者疗效可能更好。

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(2017-01-13收稿)

(2017-06-22修回)

Relationship between expression of PD-L1 and microsatellite instability of colorectal cancer and its significance

Wen FENG1,Xinxin WU2,Yongjun GUO1,Yuxi CHANG1,Qingxin XIA1

Qingxin XIA;E-mail:13838173710@139.com
1Department of Pathology,The Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450003,China;2Departrment of Molecular Pathology,The Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450003,China

Objective:To investigate the expression and clinical significance of PD-L1 in colorectal cancer(CRC).Methods:A total of 210 CRC patients who accepted radical surgery in our hospital from January 2015 to January 2016 were divided into three groups,namely,high-frequency microsatellite instability(MSI-H),low-frequency microsatellite instability(MSI-L),and microsatellite stable(MSS).The expression of PD-L1 was detected by immunohistochemistry,and the expression characteristics of PD-L1 in different types of CRC were analyzed.Results:CRC cases with low differentiation had a higher expression of PD-L1 than CRC patients with high differentiation(P<0.05).PD-L1 had a positive rate of 75.8%in the MSI-H group and a rate of 9.3%in the MSI-L and MSS groups,wherein the difference between the two groups was statistically significant(P<0.05).Conclusion:PD-L1 was positively expressed in some CRC tumor tissues,and its positive rate was significantly higher in MSI-H than in MSI-L and MSS.The therapeutic effect of a PD-L1 blocker for patients with MSI-H CRC might be preferable.

PD-L1,colorectal cancer,immunohistochemistry,significance

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.12.055

①郑州大学附属肿瘤医院(河南省肿瘤医院)病理科(郑州市450003);②分子病理科

夏庆欣 13838173710@139.com

冯稳 专业方向为消化道和胸部肿瘤的病理研究与诊断。

E-mail:manfengwen@126.com

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