不同粒径羟基磷灰石对污染土壤铜镉磷有效性和酶活性的影响

崔红标, 何 静, 吴求刚, 巨星艳, 范玉超, 仓 龙, 周 静

1.安徽理工大学地球与环境学院, 安徽 淮南 232001 2.中国科学院南京土壤研究所, 中国科学院土壤环境与污染修复重点实验室, 江苏 南京 21008

不同粒径羟基磷灰石对污染土壤铜镉磷有效性和酶活性的影响

崔红标1, 何 静1, 吴求刚1, 巨星艳1, 范玉超1, 仓 龙2, 周 静2

1.安徽理工大学地球与环境学院, 安徽 淮南 232001 2.中国科学院南京土壤研究所, 中国科学院土壤环境与污染修复重点实验室, 江苏 南京 21008

为研究不同粒径羟基磷灰石对重金属污染土壤的修复效果，采用向污染土壤添加常规磷灰石(150 μm)、微米(3 μm)和纳米(40 nm)羟基磷灰石的田间原位试验方法，考察其钝化修复5 a后对土壤铜镉磷有效性和酶活性的影响. 结果表明：3种粒径羟基磷灰石均提高了土壤pH，降低了土壤交换性酸和交换性铝的含量，且微米羟基磷灰石处理效果最好. 常规磷灰石、微米和纳米羟基磷灰石处理分别使w(离子交换态铜)降低了62.6%、74.3%和70.4%，w(离子交换态镉)降低了15.7%、25.3%和26.7%. 3种材料均增加了土壤w(TP)，其中4.61%～17.4%和73.4%～89.8%分别转化为树脂磷和稳定态磷. 微米羟基磷灰石处理分别使土壤脲酶活性和微生物量碳含量提高了4.66和0.66倍. 研究显示，微米羟基磷灰石更有利于铜和镉由活性态向非活性态转化，增加土壤磷的有效性，提高土壤微生物活性，在我国南方重金属污染红壤区具有较好的应用潜力.

羟基磷灰石; 粒径; 铜; 镉; 磷; 有效性; 土壤酶活性

Abstract： An in-situ field experiment was conducted to study the effects of ordinary hydroxyapatite (HAP, 150 μm), micro-hydroxyapatite (MHAP, 3 μm) and nano-hydroxyapatite (NHAP, 40 nm) on the availability of copper (Cu), cadmium (Cd) and phosphorus (P) and soil enzyme activities. The results showed that MHAP had the best efficiency in increasing soil pH and decreasing soil exchangeable acid and aluminum compared with the other amendments. The concentration of exchangeable fraction of Cu was decreased by 62.6%, 74.3% and 70.4%, while that of Cd was decreased by 15.7%, 25.3% and 26.7%, respectively, in HAP, MHAP and NHAP-treated soils. The three amendments increased soil total P, with 73.4%-89.8% transformed into stable-P and only 4.61%-17.4% changed into resin-P. Moreover, soil urease activities and microbial biomass carbon were 4.66 and 0.66 times those in the control. The study showed that MHAP was more effective at transforming Cu and Cd from active to inactive fractions and increasing soil available P and soil microbial activity; therefore, MHAP has good potential for the heavy metal-contaminated red soil in southern China.

Keywords： hydroxyapatite; grain size; Cu; Cd; phosphorus; availability; soil enzyme activity

重金属可以通过食物链对人体健康产生严重威胁，已成为当前全世界关注的主要问题之一[1]. 在我国，由于经济快速发展过程中缺乏完善的环保措施，尤其是在一些金属矿区、金属冶炼和加工企业周边地区，大量的可耕地被重金属污染[2]. 如国家环境保护部和国土资源部在2014年公布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，全国耕地土壤点位超标率为19.4%，主要污染物为Cd、Ni、Cu、As等. 根据2016年5月发布的《土壤污染防治行动计划》可知，我国江西、湖南、广东、广西、四川、贵州、云南等地存在污染耕地集中区域，这些地区同时也是我国典型的低磷(有效磷)红壤区[3].

近年来，研究[4-5]表明，磷基钝化材料(磷灰石、磷酸二氢钾、过磷酸钙和羟基磷灰石等)可以有效降低土壤和废水中Pb、Cd和Co等重金属活性. 尤其是羟基磷灰石(来源于脊椎动物硬组织部分如骨头和牙齿)对重金属具有强烈的吸附固定能力，目前被广泛应用于修复重金属污染的土壤和沉积物[6-7]. 这种稳定化修复方法不能降低重金属污染物的总量，仅是通过与重金属结合或使其由活性态向非活性态转化[8]. 另外，研究[9-10]表明，羟基磷灰石较常规水溶性磷肥具有低淋出率和缓慢磷释放的特性，是一种具有较大潜力的磷肥. 因此，在我国重金属污染红壤区施加磷基钝化材料羟基磷灰石不仅有助于降低重金属活性，还能够促进作物的生长.

研究表明，钝化剂的粒径显著影响土壤重金属的生物有效性和地球化学稳定性[11-12]，但目前报道的研究结果并不一致. 如CHEN等[13]发现,小于35 μm的磷矿粉颗粒较133～266 μm颗粒更能有效降低土壤重金属的生物有效性，其主要原因可能是颗粒越小，比表面积大，更有利于形成金属磷酸盐. 然而，笔者前期的室内研究发现，小于12 μm的微米羟基磷灰石较60 nm的纳米羟基磷灰石更能有效的降低铜和镉的有效性[11]. DONG等[14]研究发现，微纳米级羟基磷灰石较微米和纳米级羟基磷灰石更有助于降低污染土壤铜和镉的有效性.

另外，以上不同的研究结果都是在实验室内完成，缺少实际污染土壤的田间验证效果比较. 因此，该研究选择三种粒径羟基磷灰石(普通磷灰石粉、微米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石)为供试材料，研究其在田间尺度下连续5 a稳定化修复后对土壤酶活性、铜、镉和磷有效性的影响，以评价田间尺度下不同粒径材料稳定化效果，以期为土壤修复钝化剂的选择提供科学指导.

1 材料与方法

1.1 土壤和羟基磷灰石

研究区位于江西省贵溪市滨江乡九牛岗村，靠近一个大型铜冶炼厂和化肥厂. 试验布置前，该区域主要为废弃的水稻田，已被周边企业排放的含有重金属的废水和废气污染，主要污染物是铜(w为592 mg/kg)和镉(w为896 μg/kg)[15]. 土壤pH为4.48，阳离子交换量(CEC)为82.5 mmol/kg，w(有机碳)、w(碱解氮)、w(速效磷)、w(速效钾)分别为17、144、91、84 mg/kg，交换性酸和交换性铝含量分别为31.7和26.9 mmol/kg.

常规磷灰石粉(pH=9.12，粒径150 μm)购自湖北南漳县鑫泰磷化工；微米(pH=7.68，粒径3 μm)和纳米羟基磷灰石(pH=7.72，粒径40 nm)购自南京埃普瑞纳米材料公司. 常规磷灰石、微米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石中w(Cu)、w(Cd)分别为10.5、5.85、4.4 mg/kg和61.7、38.3、37.1 μg/kg.

1.2 试验过程

试验于2010年11月布置，共设4个处理，分别为常规磷灰石、微米和纳米羟基磷灰石以及对照处理. 其中常规磷灰石、微米和纳米羟基磷灰石用量均为表层20 cm土壤质量的1%，对照处理不添加任何钝化材料. 采用随机区组设计，每处理三次重复，每小区面积为4 m2(2 m×2 m). 各小区间采用防渗聚乙烯塑料薄膜(高出30 cm)包裹田埂，防止因雨水径流影响试验结果.

利用人工翻耕、耙匀使钝化材料与0～20 cm表层土壤充分混匀，然后用自来水清水平衡(每小区施加100 kg)1周后施复合肥、播种黑麦草. 整个试验过程中仅在2010年施加一次钝化材料，并且黑麦草仅在2010—2014年能够存活，其生物量逐渐降低. 但是试验过程中除对照处理外均有土著杂草金黄狗尾草生长. 另外，试验过程中各小区施肥、播种、田间管理方式均保持一致.

试验样品于2016年1月28日采集，此时小区杂草已经移除，样品采集深度0～20 cm. 一部分样品装于无菌自封袋中，用于土壤酶活性和微生物量碳氮的分析；另一份样品带回实验室后风干、研磨后用于土壤化学性质、铜和镉及磷有效性的分析.

1.3 分析方法

土壤和钝化材料的pH采用固液比为1∶2.5的比例添加无CO2蒸馏水，用pH电极(E-201-C，上海楚柏实验室设备有限公司)测定. 土壤w(有机碳)采用重铬酸钾湿式氧化法测定，土壤w(TN)、w(TP)、阳离子交换量、w(碱解氮)、w(速效磷)、w(速效钾)、交换性酸和交换性铝含量按照常规方法[16]测定. 土壤采用HF-HNO3-HCLO4(10 mL-5 mL-5 mL)电热板消解后，采用原子吸收(或石墨炉)分光光度计法测定w(TCu)和w(TCd). 土壤铜和镉的离子交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机结合态和残渣态含量采用Tessier分级方法[17]测定.

土壤磷分级采用Tiessen等[18]的方法测定：①树脂磷,0.5 g风干土用去离子水和阴离子交换树脂提取；②NaHCO3提取无机磷(NaHCO3-Pi)和有机磷(NaHCO3-Po),上一步残留物加入pH=8.5的0.5 mol/L NaHCO3提取；③NaOH提取无机磷(NaOH-Pi)和有机磷(NaOH-Po),上一步残留物加入0.1 mol/L NaOH提取；④NaOH提取态磷,上一步残留物加入1 mol/L NaOH提取；⑤残渣态磷,上一步残留物用H2SO4和H2O2消解提取.

土壤微生物量碳氮含量采用氯仿熏蒸-浸提方法[19]测定. 土壤过氧化氢酶、脲酶和酸性磷酸酶活性参照文献[20-21]的方法测定. 其中过氧化氢酶活性用每克土滴定H2O2消耗的0.1 mol/L KMnO4的毫升数表示，记为mL/g；脲酶和酸性磷酸酶活性采用比色法测定，分别以37 ℃下培养24 h后每g土中NH3-N 和酚的mg数表示，均记为mg/[g/(24 h)].

1.4 数据处理

用 Excel 2010对试验数据进行整理，SPSS 19.0 软件对数据进行单因素方差分析，不同处理间的最小显著性差异检验在P<0.05(LSD)水平上.

2 结果与分析

2.1 土壤性质变化

如表1所示，常规磷灰石、微米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石处理污染土壤5 a后土壤pH较对照分别显著提高了0.48、0.61和0.57个单位. 与土壤pH相似，三种钝化材料均显著增加了土壤w(TP)和w(有效磷)，其中微米和纳米羟基磷灰石处理w(TP)和w(有效磷)分别较对照增加了2.07、2.19倍以及1.49和1.16倍. 与w(有效磷)相同，三种钝化材料均显著增加了土壤w(速效钾). 与对照相比，常规磷灰石、微米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石分别使土壤交换性酸和交换性铝显著降低了75.2%、76.1%、71.6%和86.4%、87.8%、81.5%. 但是所有处理土壤间，土壤w(TN)、w(有机碳)和阳离子交换量未有显著差异.

表1 不同粒径羟基磷灰石修复后土壤化学性质的变化

注：字母不同表示处理在P<0.05水平上差异性显著. 下同.

2.2 土壤铜和镉化学形态变化

不同粒径羟基磷灰石处理后土壤铜和镉化学形态变化如表2所示. 对照处理中，五种形态铜的分布规律为：残渣态>离子交换态>有机结合态>碳酸盐结合态>铁锰氧化物结合态. 三种粒径羟基磷灰石处理后，铜化学形态的分布均表现为残渣态>铁锰氧化物结合态>碳酸盐结合态>有机结合态>离子交换态. 其中常规磷灰石、微米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石处理w(离子交换态铜)较对照分别显著降低了62.6%、74.3%和70.4%. 三种粒径羟基磷灰石处理均提高了土壤w(碳酸盐结合态铜)和w(铁锰氧化物结合态铜)，但是未对w(有机结合态铜)和w(残渣态铜)产生显著影响. 然而，与对照相比，微米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石处理w(TCu)分别显著提高了20和25 mg/kg.

由表2可知，对照处理中，五种形态镉的分布规律为残渣态>离子交换态>碳酸盐结合态>铁锰氧化物结合态>有机结合态. 与铜相似，常规磷灰石、微米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石处理w(离子交换态镉)较对照分别显著降低了15.7%、25.3%和26.7%. 另外，三种粒径羟基磷灰石处理后均显著增加了w(铁锰氧化物结合态镉)和w(有机结合态镉)，但是对w(残渣态镉)和w(TCd)没有显著影响.

表2 不同粒径羟基磷灰石修复后土壤铜和镉化学形态变化

2.3 土壤磷化学形态变化

如表3所示，常规磷灰石、微米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石处理分别使土壤w(树脂磷)和w(NaOH 提取态无机磷)较对照提高了0.35、1.05和1.52倍以及0.35、0.77和0.73倍. 另外，三种粒径材料均提高了土壤w(NaHCO3提取态无机磷)和w(NaOH 提取态有机磷). 与树脂磷变化相似，常规磷灰石、微米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石处理土壤w(HCl提取态磷)和w(残渣态磷)分别较对照提高了6.55、6.25和7.02倍以及3.69、3.44和3.05倍. 但是，三种粒径材料对土壤w(NaHCO3提取态有机磷)的影响较小.

表3 不同粒径羟基磷灰石修复后土壤磷化学形态变化

2.4 土壤酶活性和微生物量碳氮变化

三种粒径材料对土壤酶活性和微生物量碳氮的影响如图1所示. 对于土壤过氧化氢酶活性，三种材料的添加均未对其产生显著影响. 常规磷灰石和微米羟基磷灰石处理使土壤脲酶活性较对照显著增加了2.11和4.46倍，但纳米羟基磷灰石处理未表现出显著差异. 与对照相比，常规磷灰石处理微弱降低了土壤酸性磷酸酶活性，但是微米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石对土壤酸性磷酸酶活性的影响较小. 另外，与对照相比，常规磷灰石、微米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石处理较对照分别使土壤微生物量碳含量增加了0.56、0.66和0.58倍，但仅常规羟基磷灰石处理显著增加了土壤微生物量氮的含量.

注：图中误差棒上的字母不同表示处理在P<0.05水平上差异性显著.图1 不同粒径羟基磷灰石修复后土壤酶活性和微生物量碳氮变化Fig.1 Soil enzyme activities and microbial biomass carbon and nitrogen in soils amended by different grain sizes of hydroxyapatite

3 讨论

羟基磷灰石是一种碱性材料(pH>7.6)，其溶解过程〔见式(1)〕能够消耗大量H+[22]，因而可以增加土壤pH，导致土壤交换性酸和交换性铝含量的降低. 与此相同，WEI等[23]研究也表明，纳米羟基磷灰石的添加较对照土壤pH显著增加了1.8个单位. 另外，尽管常规羟基磷灰石材料具有最高的pH，但是笔者研究结果表明修复5 a后，微米羟基磷灰石对土壤pH的提高幅度最好，其次是纳米羟基磷灰石. 这可能是由于常规的磷灰石中除含有羟基磷灰石外，还含有一定量的碳酸钙，其在酸性条件下快速溶解，导致其对土壤pH的维持效果不如微米和纳米羟基磷灰石. 处理后土壤速效钾较对照增加可能是由于三种钝化材料本身含有一定量的钾，增加了土壤中w(TK)；黑麦草的生长改变微生物群落结构促进土壤钾活性的提高. 另外，研究区域土壤的总氮和总磷较其他地区处于较高的水平，主要是由于该研究区靠近一个化肥厂，前期土壤灌溉了含有大量氮磷的废水，导致其w(TN)和w(TP)逐渐增加.

Ca10(PO4)6(OH)2+ 14H+= 10Ca2++

6H2PO4-+2H2O

(1)

与前期的室内研究结果[11]一致，大田试验条件下微米和纳米羟基磷灰石能够显著降低土壤w(离子交换态铜)和w(离子交换态镉). 其主要原因是由于三种材料均提高了土壤pH，降低了交换性酸和交换性铝含量，增加了土壤对重金属的固定能力. 且该研究中土壤w(离子交换态铜)和w(离子交换态镉)均与pH呈现极显著的负相关关系，与交换性酸和交换性铝含量均呈现极显著的正相关关系(数据未列出). 因为土壤pH可用来表示土壤活性酸度，是土壤溶液中H+浓度的直接反映；交换性酸、交换性铝可用来表达土壤潜性酸度，是土壤胶体吸附的可代换性H+和Al3+. 因此，土壤酸度是影响土壤重金属活性的关键因子. 此外，一些研究[7,24]表明羟基磷灰石主要是通过离子交换、表面络合和共沉淀等作用，降低重金属的活性. Siebers等[25]指出高含量镉下，磷酸盐材料主要是通过形成磷酸盐沉淀来降低土壤镉的有效性. DONG等[14]研究进一步表明，不同粒径的羟基磷灰石对铜和镉吸附固定存在机理上的差异，微纳米羟基磷灰石的表面特性和结构特点使得其具有更多的吸附位点，提高对铜和镉的吸附能力. 通常，材料粒径越小，比表面积和表面能越大，对重金属的吸附固定能力更强[13]，但该研究中微米羟基磷灰石对铜和镉活性的降幅要优于常规磷灰石和纳米羟基磷灰石. 在前期的研究中笔者认为，这可能是由于纳米羟基磷灰石在土壤中发生团聚，失去了纳米材料的特性[11]，导致微米羟基磷灰石对重金属具有较好钝化效果.

此外，与对照相比，钝化材料的应用均不同程度的提高了土壤w(TCu)和w(TCd)，这与笔者前期的研究结果[26]一致. 这可能是由于尽管该地区目前已经不再遭受灌溉水带入的重金属污染，但是仍然存在大气干湿沉降的重金属污染. 如陶美娟等[27]的研究表明，该地区干湿沉降的铜和镉含量年均达到1 973和15.2 mg/m2. 另外，笔者前期通过比较重金属输入(钝化材料输入和大气干湿沉降输入)和输出(植物吸收、地表径流和向下淋溶)发现，钝化材料(常规磷灰石、石灰和木炭)的添加均提高了土壤对铜和镉的吸附固定能力，减少了通过地表径流和淋溶作用输出的重金属，且其减少的重金属输出量大于通过植物提取和地表径流输出的重金属总量，因而导致改良后表层土壤重金属总量高于对照处理[26,28]. 因此，在实际的土壤修复过程中，完全截断外源污染物的输入尤其必要.

同时，羟基磷灰石的添加显著增加了土壤w(TP)，其在溶解过程也会导致大量磷的溶出[10]，因此可以显著增加土壤w(有效磷). 与土壤有效磷变化相同，常规磷灰石、微米和纳米羟基磷灰石的添加增加了土壤树脂磷，但是仅占总磷的4.61%、12.6%和17.4%. 同样，Rivaie等[29]研究也表明磷灰石和过磷酸钙的应用可以显著增加土壤w(树脂磷). 根据文献[30]，活性无机磷(NaHCO3-Pi)和中度活性无机磷(NaOH-Pi)更有可能被植物吸收和利用，该研究中微米和纳米羟基磷灰石处理的土壤均高于对照和普通磷灰石处理，因此更有利于植物生长. 类似地，LIU等[9,31]研究发现，有机和无机磷改良材料的应用均增加了土壤NaHCO3-Pi和NaOH-Pi的含量. 因为HCl提取态磷主要来源于土壤磷灰石、钙磷及其他负电荷氧化物结合态磷[32]，所以该研究中三种粒径羟基磷灰石材料均显著增加了土壤HCl提取态磷.

总的来看，三种粒径材料的添加均提高了土壤w(活性磷)、w(中度活性磷)和w(稳定态磷)，且对稳定态磷的提高幅度最大. 另外，微米和纳米羟基磷灰石对活性磷的提高优于常规磷灰石. 但是，添加的三种粒径材料处理土壤中，73.4%～89.8%增加的总磷都是以稳定态磷(HCl提取态和残渣态)形式存在，这可能导致我国南方地区土壤有效磷较低的一个原因. 这也表明，羟基磷灰石钝化材料在我国南方重金属污染的缺磷(有效磷低)土壤中具有较大应用潜力，既能够钝化重金属，又可以通过有效磷的提升，促进作物的增产. 但是要控制好用量，因为w(树脂磷)过高，容易导致水体的富营养化[33]. 如前期的室内淋溶试验发现，没有作物生长的情况下，0.5%用量的羟基磷灰石处理镉污染土壤，淋出液磷的含量达到0.50～1.42 mg/L，超过了GB 3838—2002《地表水环境质量标准》Ⅴ类水标准〔ρ(TP)为0.4 mg/L〕[34].

土壤微生物活性是评价土壤污染的一个重要特性，尤其是土壤酶活性，其在养分循环、有机质转化、土壤理化性质、微生物活性方面具有重要作用，常用于土壤质量的评价[35-36]. 该研究结果表明，微米羟基磷灰石处理能够显著增加土壤脲酶和过氧化氢酶活性，纳米羟基磷灰石处理对土壤酶活性未有显著影响. 另外，该研究也表明，三种材料粒径的应用均有利于土壤微生物量碳的提高. 可见，总体上微米羟基磷灰石处理更有利于土壤酶活性和微生物量碳的增加. 这可能是由于材料的应用显著提高了土壤pH，降低了土壤铜和镉的活性，改变了土壤微生物群落结构，导致土壤微生物活性的增加. 同时，黑麦草和土著植物杂草金黄狗尾草的残落物、根系分泌物和根际微生物影响土壤微生物群落结构，提高土壤微生物活性. 如WEI等[23]的研究发现，纳米HAP处理后提高了黑麦草生物量和土壤脲酶和脱氢酶的活性，并改变了土壤微生物多样性和群落结构，尤其是增加了土壤中Stenotrophomonassp.和Bacteroides的数量.

4 结论

a) 微米羟基磷灰石较常规磷灰石和纳米羟基磷灰石更有利于提高土壤pH，降低土壤交换性酸和交换性铝含量；随着常规磷灰石、微米和纳米羟基磷灰石的添加，土壤中w(离子交换态铜)降低了62.6%、74.3%和70.4%，w(离子交换态镉)降低15.7%、25.3%和26.7%.

b) 常规磷灰石、微米和纳米羟基磷灰石显著提高了土壤w(TP)，其中的4.61%～17.4%和73.4%～89.8%分别转化为树脂磷和稳定态磷.

c) 常规磷灰石、微米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石的添加分别使土壤微生物量碳含量增加了0.56、0.66和0.58倍，且常规磷灰石和微米羟基磷灰石处理使土壤脲酶活性增加了2.11和4.46倍，但仅有常规磷灰石处理显著增加土壤微生物量氮的含量.

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Effects of Availability of Cu, Cd and Phosphorus and Soil Enzyme Activities on Contaminated Soils Using Hydroxyapatite with Different Grain Sizes

CUI Hongbiao1, HE Jing1, WU Qiugang1, JU Xingyan1, FAN Yuchao1, CANG Long2, ZHOU Jing2

1.School of Earth and Environment, Anhui University of Science and Technology, Huainan 232001, China 2.Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy Sciences, Nanjing 210008, China

2016-11-12

2017-02-07

安徽省高等学校自然科学研究项目(KJ2016A191)；国家级大学生创新训练计划项目 (201610361003)；安徽理工大学青年教师研究基金(QN201621)

崔红标(1985-), 男, 安徽淮南人, 讲师, 博士, 主要从事重金属污染土壤修复研究, cuihongbiao0554@163.com.

X53

1001- 6929(2017)07- 1146- 08

A

10.13198/j.issn.1001- 6929.2017.02.04

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