黑鱼鱼胆抗炎活性成分研究

吴小东，戚微岩，董 瑶，葛 闯，徐寒梅

(中国药科大学多肽药物创制工程研究中心，江苏 南京 211198)

黑鱼鱼胆抗炎活性成分研究

吴小东，戚微岩，董 瑶，葛 闯，徐寒梅

(中国药科大学多肽药物创制工程研究中心，江苏 南京 211198)

目的 研究黑鱼鱼胆的抗炎成分活性。方法 采用萃取、硅胶柱层析等方法进行分离纯化，然后通过氢谱、碳谱对分离出的单体进行结构鉴定，利用小鼠脾淋巴细胞增殖实验和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放一氧化氮(nitrogen monoxide，NO)实验评价黑鱼鱼胆抗炎活性成分。结果 利用活性追踪的方法分离得到化合物牛黄胆酸钠(C1)和化合物牛黄鹅去氧胆酸钠(C2)，且两个化合物对刀豆蛋白A(Concanavalin A，Con A)诱导小鼠脾淋巴细胞增殖实验的细胞相对活力分别为65.9%±11.7%、60.5%±9.4%，与模型组相比差异均具有极显著性(P<0.01)；对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO的量分别为(16.4±1.9)、(15.5±1.7) μmol·L-1，与模型组相比差异均具有极显著性(P<0.01)。结论 黑鱼鱼胆中牛黄胆酸钠和牛黄鹅去氧胆酸钠具有一定的抗炎活性且对正常脾淋巴细胞和巨噬细胞无毒性作用。

黑鱼；抗炎；牛黄胆酸钠；牛黄鹅去氧胆酸钠；淋巴细胞；巨噬细胞

黑鱼(Channaargus)为鳢科鳢种Channidae动物，在《本草纲目》中记载“黑鱼鱼胆气味：甘，平，诸鱼胆苦，惟此胆甘可食为异也。”并提到具有治疗喉痹的作用。现代研究未见关于黑鱼鱼胆的药效和成分研究。本文通过小鼠脾细胞增殖实验和LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO活性实验追踪的方法从黑鱼胆汁中分离出化合物(C1)牛黄胆酸钠和化合物(C2)牛黄鹅去氧胆酸钠，并对其构效关系进行了初步探讨，以期为牛黄胆酸钠和牛黄鹅去氧胆酸钠的后续研究提供参考[1-5]。

1 仪器与材料

旋转蒸发器 RE-3000(上海亚荣生化仪器厂)，分析型高效液相色谱仪(岛津公司，型号：LC-2010A)，立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备)，XD-202荧光倒置生物显微镜(南京江南永新光学有限公司)，超净台(苏州净化设备有限公司)，烘箱(上海跃进医疗器械一厂)，色谱柱(北京绿百草科技发展有限公司)，超纯水制造仪(成都超纯科技有限公司)，CO2培养箱(美国Shellab公司)，电子天平(d=0.001 g，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，电子天平(d=0.01 mg，赛多利斯科学仪器有限公司)，移液枪(赛默飞世尔科技有限公司)。

硅胶(200～300目)(上海灵一工贸有限公司)，甲醇(南京化学试剂有限公司)，乙醇(南京化学试剂有限公司)，乙腈(ROE SCIENTIFIC INC公司)，乙酸乙酯(南京化学试剂有限公司)，氯仿(南京化学试剂有限公司)，正丁醇(南京化学试剂有限公司)，青霉素(美国Amresco公司)，链霉素(美国Amresco公司)，NH4Cl(南京化学试剂有限公司)，Na2HPO4·12H2O(南京化学试剂有限公司)，KH2PO4(南京化学试剂有限公司)，NaCl(南京化学试剂有限公司)，KCl(南京化学试剂有限公司)，Tris(南京化学试剂有限公司)，NaHCO3(南京化学试剂有限公司)，DMEM(美国Gibco公司)，胎牛血清(BI)，MTT(Biosharp)。

2 方法

2.1 提取与分离 取黑鱼胆汁10 mL，加入等体积氯仿萃取3次、再加入乙酸乙酯萃取3次，最后用等体积正丁醇萃取3次，分别得到氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。将各相减压蒸干，分别得到样品粗提物127、34、206、23 mg。

将正丁醇萃取相粗提物进行硅胶柱(200～300目)分离，采用干法装柱和干法上样；用乙酸乙酯 ∶甲醇=4 ∶1进行等度洗脱，并用薄层色谱进行跟踪检测；将相同样品进行合并、减压浓缩；减压蒸干后用少量甲醇进行溶解，取出溶液，在室温进行挥干；得到纯化样品C1(23 mg)和纯化样品C2(16 mg)，最后用氢谱、碳谱对两个样品进行结构确认[6-7]。

2.2 抗炎活性研究

2.2.1 小鼠脾淋巴细胞增殖实验和对正常脾淋巴细胞的毒性作用 将小鼠眼眶放血致死，75%乙醇浸泡5～10 min，于超净工作台中取出脾脏并将脾脏至于无菌细胞筛上(200目)，研磨，收集研磨液离心(1 000 r·min-1，5 min)，用Tris-氯化铵溶液洗涤细胞3次，然后用培养基重悬；最后将细胞进行台盼蓝活细胞染色，存活率95%以上，调整活细胞浓度为2×106个每毫升，于96孔板每孔加入细胞100 μL；抑制脾淋巴细胞增殖实验组加入ConA与加入药物同时进行，毒性实验组只加入药物进行治疗，每组设置6个复孔，将96孔板在37 ℃，5% CO2培养箱中孵育48 h；向96孔板中加入5 g·L-1的MTT，每孔20 μL，于培养箱中继续培养4 h；弃去96孔板中的培养液，每孔加入100 μL DMSO，轻轻混匀，用酶标仪于测量波长570 nm，参比波长630 nm处测定吸光值[8]，根据吸光值计算相对活细胞数。

2.2.2 巨噬细胞释放NO实验和对巨噬细胞毒性作用 将冻存的小鼠巨噬细胞RAW264.7从液氮罐中取出，放入37 ℃水浴复苏，800 r·min-1离心5 min，弃去上清液，混悬细胞，接种于细胞培养瓶中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取处于对数生长期的RAW264.7细胞进行收集、重悬调整细胞浓度为5×105个每毫升，于96孔板中每孔加入细胞100 μL，n=5，过夜，次日，抑制巨噬细胞释放NO组用LPS(2.5 mg·L-1)进行诱导，与此同时，给予药物进行治疗，毒性实验组只进行药物治疗，药物作用24 h后，收集细胞培养液，离心，取上清，用NO检测试剂A液(50 μL)、B液(50 μL)，常温静置反应10 min后酶标仪540 nm下检测OD值，根据标曲计算细胞上清液中的NO含量[9-10]，毒性实验组中向96孔板中加入5 g·L-1的MTT，每孔20 μL，于培养箱中继续培养4 h；弃去96孔板中的培养液，每孔加入100 μL DMSO，轻轻混匀，用酶标仪于测量波长570 nm，参比波长630 nm处测定吸光值[8]，计算相对活细胞数。

3 结果

3.1 结构鉴定 化合物(C1)：白色无定形粉末，1H-NMR(300 MHz，CD3OD)δ：3.95(1H，s，H-3)，3.79(1H，s， H-7)，3.35(1H，s， H-12)，3.60(2H，t，J=6.6 Hz，H-1′)，2.97(2H，t，J=6.6 Hz，H-2′)，0.71(3H，s， H-21)，0.91(3H，s， H-19)，1.08(3H，d，J=5.6 Hz，H-18)13C-NMR(300 MHz，CD3OD)δ：37.0(C-1)，31.7(C-2)，73.4(C-3)，41.0(C-4)，43.5(C-5)，36.4(C-6)，69.5(C-7)，41.5(C-8)，28.4(C-9)，36.4(C-10)，30.1(C-11)，74.5(C-12)，48.0(C-13)，43.7(C-14)，24.7(C-15)，29.2(C-16)，48.5(C-17)，18.5(C-18)，23.6(C-19)，37.4(C-20)，18.3(C-21)，34.7(C-22)，33.6(C-23)，177.5(C-24)，37.1(C-1′)，52.0(C-2′)，以上数据与文献报道基本一致[11]，故化合物(C1)为牛黄胆酸钠(Fig 1：C1)。

化合物(C2)：白色无定形粉末，1H-NMR(300 MHz，CD3OD)δ： 3.79(1H，s， H-3)，3.35(1H，s， H-7)，3.60(2H，t，J=6.6 Hz，H-1′)，2.98(2H，t，J=6.6 Hz，H-2′)，0.69(3H，s， H-21)，0.92(3H，s，H-19)，0.98(3H，d，J=6.2 Hz，H-18)13C-NMR(300 MHz，CD3OD)δ：36.9(C-1)，31.9(C-2)，73.4(C-3)，41.3(C-4)，43.7(C-5)，36.4(C-6)，69.5(C-7)，41.6(C-8)，25.1(C-9)，36.7(C-10)，29.8(C-11)，41.0(C-12)，48.7(C-13)，44.2(C-14)，25.1(C-15)，29.8(C-16)，48.9(C-17)，12.7(C-18)，23.9(C-19)，37.1(C-20)，19.4(C-21)，34.7(C-22)，33.6(C-23)，177.5(C-24)，37.1(C-1′)，52.1(C-2′)， 以上数据与文献报道基本一致[12]，故化合物(C2)为牛黄鹅去氧胆酸钠(Fig 1：C2)。

3.2 抗炎活性

3.2.1 小鼠脾淋巴细胞增殖实验和对正常脾细胞的毒性作用 在利用Con A诱导小鼠脾淋巴细胞增殖实验筛选黑鱼鱼胆的抗炎活性中，阳性药地塞米松、黑鱼鱼胆粗提物25、50、100 mg·L-1、氯仿萃取相(50 mg·L-1)、乙酸乙酯萃取相(50 mg·L-1)、正丁醇萃取相(50 mg·L-1)和水相(50 mg·L-1)细胞相对活力分别为52.5%±8.1%、86.7%±3.9%、73.2%±7.7%、60.0%±9.0%、95.7%±7.9%、90.4%±6.6%、64.0%±5.9%、99.4%±10.0%，其中阳性药地塞米松、黑鱼鱼胆粗提物50、100 mg·L-1、正丁醇萃取相与模型组(100.0%±7.9%)比较差异具有极显著性(P<0.01)(Fig 2)；然后继续对正丁醇相进行分离纯化得到的化合物牛黄胆酸钠(C1)和牛黄鹅去氧胆酸钠(C2)进行小鼠脾淋巴细胞增殖实验和毒性实验，药物浓度50 mg·L-1的细胞相对活力分别为65.9%±11.7%、60.5%±9.3%(Fig 3，Fig 4)，与模型组(100.0%±9.8%、100.0%±3.7%)相比差异均具有极显著性(P<0.01)；毒性实验结果显示除阳性药地塞米松组(细胞相对活力为：76.8%±5.1%，正常组细胞相对活力：100.0%±2.8%)有明显脾淋巴细胞毒性外，其余各个给药组与正常组比较差异无显著性，说明化合物C1和化合物C2能明显地抑制Con A诱导脾淋巴细胞产生的炎症反应，且对小鼠脾淋巴细胞无毒性作用(Fig 5)。

Fig 1 Molecular structure of C1 and C2

C1: Sodium taurocholate; C2: Sodium taurochenodeoxycholate

Fig 2 Spleen lymphocyte proliferation assay

1: Normal; 2: Model(ConA:5 mg·L-1); 3: Hexadecadrol(20 mg·L-1);4:Crude Extracts(25 mg·L-1);5:Crude Extracts(50 mg·L-1);6:Crude Extracts(100 mg·L-1);7:Chloroform extract phase(50 mg·L-1);8:Ethyl acetate extract phase(50 mg·L-1);9:Normal butanol extract phase(50 mg·L-1);10:Water extract phase(50 mg·L-1);##P<0.01vs1(normal group);**P<0.01vs2(model group)

Fig 3 Spleen lymphocyte proliferation assay of C1

1: Normal; 2: Model(ConA: 5 mg·L-1);3:Hexadecadrol(20 mg·L-1);4:3.125 mg·L-1;5:6.25 mg·L-1;6:12.5 mg·L-1;7:25 mg·L-1;8:50 mg·L-1;##P<0.01vs1(normal group);**P<0.01vs2(model group)

Fig 4 Spleen lymphocyte proliferation assay of C2

1: Normal; 2: Model(ConA:5 mg·L-1);3:Hexadecadrol(20 mg·L-1);4:3.125 mg·L-1;5:6.25 mg·L-1;6:12.5 mg·L-1;7:25 mg·L-1;8:50 mg·L-1;##P<0.01vs1(normal group);*P<0.05,**P<0.01vsG2(model group)

3.2.2 巨噬细胞释放NO实验和对巨噬细胞毒性作用 在利用LPS诱导巨噬细胞RAW264.7释放NO实验中阳性药双氯芬酸钠、化合物C1(50 mg·L-1)和化合物C2(50 mg·L-1) NO释放量分别为(4.0±2.2)、(16.4±1.9)、(15.5±1.7) μmol·L-1和模型组(30.7±2.8) μmol·L-1相比差异均具有极显著性(P<0.01)(Fig 6)，巨噬细胞毒性实验结果显示各个给药组与空白组比较差异无显著性，说明化合物C1和化合物C2能极显著地抑制LPS诱导巨噬细胞产生的炎症反应，且对巨噬细胞无毒性作用(Fig 7)。

Fig 5 Cytotoxic effect of C1 and C2 on spleen lymphocytes

1: Normal; 2: Hexadecadrol(20 mg·L-1); 3: C1 (12.5 mg·L-1); 4: C1(25 mg·L-1);5:C1(50 mg·L-1);6:C2(12.5 mg·L-1);7:C2(25 mg·L-1);8:C2(50 mg·L-1).**P<0.01vsnormal group

Fig 6 LPS-induced mouse macrophage RAW264.7 releasing NO

1: Normal; 2: Model(LPS：2.5 mg·L-1); 3: Diclofenac sodium(25 mg·L-1); 4: C1(12.5 mg·L-1); 5: C1(25 mg·L-1); 6: C1(50 mg·L-1); 7: C2(12.5 mg·L-1); 8: C2(25 mg·L-1); 9: C2(50 mg·L-1) .##P<0.01vs1(normal group);**P<0.01vs2(model group)

Fig 7 Cytotoxic effect of C1 and C2 on macrophage

1: Normal; 2: Diclofenac sodium(25 mg·L-1); 3: C1(12.5 mg·L-1); 4: C1(25 mg·L-1); 5: C1(50 mg·L-1); 6: C2(12.5 mg·L-1); 7: C2(25 mg·L-1); 8: C2(50 mg·L-1)

4 讨论

牛黄胆酸钠在牛、羊、蛇等动物胆汁中都有被发现，而在鱼类中只有在太阳鱼、鲟鱼中有含牛黄胆酸钠的相关报道。牛黄鹅去氧胆酸钠在鸡、蛇等动物胆汁中有相关报道，在鱼类中未见含牛黄鹅去氧胆酸钠的相关报道。目前，关于牛黄胆酸钠和牛黄鹅去氧胆酸钠的药理活性的研究有抗炎、镇咳、祛痰等作用，未见关于从细胞水平的抗炎活性和毒性研究。

脾脏作为机体最大的免疫器官含有60%的B淋巴细胞和40%的T淋巴细胞，当抗原和异物进入脾脏后发生免疫识别、免疫应答、免疫效应，从而释放炎症因子，正常情况下，这些细胞因子可以帮助机体消灭异物，而大量的细胞因子的产生则会引起炎症反应[13]。Con A能非特异性的刺激淋巴细胞发生增殖，产生过量的炎症因子。因此，通过Con A刺激脾淋巴细胞增殖实验，可以用以抗炎药物的活性筛选。机体清道夫——巨噬细胞，能吞噬机体内坏死细胞、病原体等多种异物，同时也参与机体免疫防御、免疫监视、免疫调节等多个阶段，在免疫和炎症方面发挥着举足轻重的作用；脂多糖作为细菌内毒素能刺激巨噬细胞产生大量的IL-1、IL-6、NO等炎症介质，从而引起机体炎症反应[14-15]。

本研究通过抗炎活性追踪的方法首次从黑鱼鱼胆中提取分离得到牛黄胆酸钠和牛黄鹅去氧胆酸钠，并通过体外小鼠脾淋巴细胞增殖实验和LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO，实验证明牛黄胆酸钠和牛黄鹅去氧胆酸钠可以通过抑制炎症介质诱导小鼠脾淋巴细胞的增殖和巨噬细胞炎症因子的释放共同发挥抗炎作用，经过实验对比发现，牛黄鹅去氧胆酸钠的抗炎作用优于牛黄胆酸钠，并且通过毒性实验发现对正常脾淋巴细胞和巨噬细胞均无毒性作用。

(致谢:感谢中国药科大学徐寒梅教授、戚微岩老师对本文的指导，同时也感谢江苏高校优势学科建设工程的资助、中国药科大学多肽药物创制工程研究中心提供研究平台及实验室老师，同学的帮助。)

[1] Hoang l S, Tran M H, Nguyen V T, et al. Isolation of a new homomonoterpene from Madhuca pasquieri and effect of isolated compounds on NO production[J].NatProdCommun, 2016, 11(6): 729-32.

[2] 李培锋, 薛 原, 关 红. 牛磺胆酸抗炎作用研究[J].内蒙古农业大学学报,2007,28(1): 1-5.

[2] Li P F, Xue Y, Guan H. Studies on anti-inflammatory effect of taurocholic acid[J].JInnerMongoliaAgricUniver, 2007, 28(1): 1-5.

[3] 花慧莲, 黄 超. 热休克蛋白70激动剂SW02对脂多糖诱导的巨噬细胞iNOS表达的调控及机制[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(2): 279-84.

[3] Hua H L, Huang C. Effects of heat shock protein 70 activator SW02 on lipopolysaccharide-induced expression of inducible nitric oxide synthase in macrophages[J].ChinPharmacolBull, 2016, 32(2): 279-84.

[4] Chan P M, Tan Y S, Chua K H,et al. Attenuation of inflammatory mediators(TNF-α and nitric oxide) and up-regulation of IL-10 by wild and domesticated basidiocarps of amauroderma rugosum(Blume & T. Nees) Torrend in LPS-stimulated RAW264.7 Cells[J].PloSOne, 2015, 10(10): e0139593.

[5] Zhou F, Yan S, Chen S, et al. Optimization extraction process of polysaccharides from suillus granulatus and their antioxidant and immunological activitiesInvitro[J].PharmacognMag, 2016, 12(Suppl 2): S277-S84.

[6] 刘欣媛, 李培锋. 牛、羊胆汁中牛磺胆酸提取工艺的对比[J]. 包头医学院学报, 2011, 27(5): 3-4.

[6] Liu X Y, Li P F. Contrast on extraction techniques of taurocholic acid from cattle bile and sheep bile[J].JBaotouMedColl, 2011, 27(5): 3-4.

[7] 袁 捷, 陈志维, 武 文,等. 人工养殖蟒蛇胆汁中牛磺胆酸钠的含量测定[J].中医药信息, 2010, 27(5): 14-6.

[7] Yuan J, Chen Z W, Wu W, et al. Determination of sodium Taurocholate in the Bile of Cultured Python by HPLC[J].InfTraditChinMed, 2010, 27(5): 14-6.

[8] Sharma R, Tiku A B. Emodin inhibits splenocyte proliferation and inflammation by modulating cytokine responses in a mouse model system[J].JImmunotoxicol, 2015, 13(1): 20-6.

[9] 蔡海兰, 黄晓君, 聂少平, 等. 铁皮石斛多糖对RAW2647细胞分泌TNF-α的影响[J]. 中国药理学通报, 2012, 28(11): 1553-6.

[9] Cai H L, Huang X J, Nie S P, et al. Effects of polysaccharides from Dendrobium Officinale on the production of TNF-α by RAW264.7 cells[J].ChinPharmacolBull, 2012, 28(11): 1553-6.

[10]Song J L, Yi R K, Gao Y. Anti-inflammatory effect of methanolic extract of Conyzacanadensis in lipopolysaccharide(LPS)-stimulated RAW264.7 murine macrophage cells[J].PakJPharmSci, 2016, 29(3): 935-40.

[11]Miyamoto H, Nukaya H, Tsuji K. Study on the bile salts from Sunfish, Mola mola L. The structures of sodium cyprinol sulfates, the sodium salt of a new bile acid conjugated with taurine, and a new bile alcohol and its new sodium sulfates[J].ChemPharmBull,1998,46(1):12-6.

[12]Luo Q, Chen Q, Wu Y, et al. Chemical constituents of bear bile[J].ChinaJChinMatMed,2010,35(18): 2416-9.

[13]Zhu Z Y, Meng M, Sun H, et al. Immunostimulatory activity of glycopeptides from Paecilomyces sinensis under normal and cyclophosphamide induced immunosuppressive conditions in mice models[J].FoodFunct, 2016, 7(8): 3566-76.

[14]Montana G, Lampiasi N. Substance P Induces HO-1 expression in RAW 264.7 cells promoting switch towards M2-like macrophages[J].PloSOne, 2016, 11(12): e0167420.

[15]Han M H, Lee W S, Nagappan A, et al. Flavonoids isolated from flowers of lonicera japonica thunb. Inhibit inflammatory responses in BV2 microglial cells by suppressing TNF-α and IL-β through PI3K/Akt/NF-κb signaling pathways[J].PhytotherRes, 2016, 30(11): 1824-32.

Study on anti-inflammatory activities of bile fromChannaargus

WU Xiao-dong, QI Wei-yan, DONG Yao, GE Chuang, XU Han-mei
(TheEngineeringResearchCenterofPeptideDrugDiscoveryandDevelopment,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing211198,China)

Aim To study the anti-inflammatory activity of theChannaargusbile.Methods The bile was isolated and purified by extraction and silica gel column chromatography. Then the compounds were identified by hydrogen and carbon spectra. The spleen lymphocytes proliferation assay and Lipopolysaccharide(LPS) induced mouse macrophage RAW264.7 releasing Nitrogen Monoxide(NO) experiment were used to evaluate the anti-inflammatory activity.Results Compound(C1) of sodium taurocholate and compound(C2) of sodium taurochenodeoxycholate were isolated by activity tracing. The cell relative viabilities of the two compounds on Concanavalin A(Con A) induced spleen lymphocytes proliferation assay were 65.9%±11.7% and 60.5%±9.4%, which were significantly different from the result of model group (P<0.01), respectively. The NO production of LPS-induced RAW264.7 release of NO was (16.4±1.9) μmol·L-1and (15.5±1.7) μmol·L-1, which were significantly different from the result of model group(P<0.01).Conclusion Sodium taurocholate and sodium taurochenodeoxycholate fromChannaargusperform the anti-inflammatory activities but have no cytotoxic effect on spleen lymphocytes and macrophage.

Channaargus; anti-inflammatory; sodium taurocholate; sodium taurochenodeoxycholate; lymphocytes; macrophage

2017-02-07，

2017-03-12

江苏高校优势学科建设工程资助项目

吴小东(1992-)，男，硕士生，研究方向：海洋天然产物及活性，E-mail：wuxiaodongcpu@126.com； 徐寒梅(1966-)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：多肽药物研究与开发，通讯作者，E-mail： 13913925346@126.com

时间：2017-6-7 19:04 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.022.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.011

A

1001-1978(2017)07-0941-05

R-332；R282.74；R284.1；R287；R322.21；R329.24