基于线粒体COⅠ和ND1基因分析三尾凤蝶遗传多样性

赵 健, 胡劭骥, 和秋菊, 易传辉, 和 菊, 冯志伟, 杨建华, 陈 鹏

(1.西南林业大学，云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224；2.云南大学农学院，云南 昆明 650223；3.云南省林业科学院，云南 昆明 650201)



基于线粒体COⅠ和ND1基因分析三尾凤蝶遗传多样性

赵 健1, 胡劭骥2, 和秋菊1, 易传辉3, 和 菊3, 冯志伟3, 杨建华3, 陈 鹏3

(1.西南林业大学，云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224；2.云南大学农学院，云南 昆明 650223；3.云南省林业科学院，云南 昆明 650201)

以云南和四川分布的3个种群(云南丽江种群、云南东川种群、四川种群)共36头三尾凤蝶为研究对象，选取线粒体COⅠ和ND1基因作为分子标记，对三尾凤蝶的遗传多样性进行了研究.结果表明，PCR扩增测得COⅠ和ND1基因联合序列长度为1 913 bp，A+T含量为74.3%，表现出明显的A/T碱基偏向性；共检测到4个变异位点，定义了5个单倍型，其中，Ha1出现的频率较高，为共享单倍型.核苷酸和单倍型多样性指数分别为0.000 2和0.218 0；遗传分化系数(Gst)、固定系数(Fst)、基因流(Nm)和遗传距离分别为0.059 98、0.059 95、3.920 00和0.分析显示，三尾凤蝶遗传多样性低，各地理种群基因交流频繁，没有形成明显分化.

三尾凤蝶; 线粒体；COⅠ; ND1; 遗传多样性; 遗传分化

三尾凤蝶(BhutanitisthaidinaBlanchard)，属鳞翅目凤蝶科尾凤蝶属Bhutanitis，多生活于海拔2 000 m以上的山区，主要分布在中国横断山及其周边地区，具有很高的科学研究价值和观赏价值，是世界珍稀物种.世界自然保护联盟(International Union for Conservation of Nature,IUCN)在《受威胁的世界凤蝶》中将其列为R级，濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)附录Ⅱ保护物种，现已为濒危物种[1].因此，加强对该物种保护已迫在眉睫.

一个物种对环境变化的适应能力主要取决于其群体内部的遗传多样性和相应的遗传结构[2].遗传多样性是目前保护生物学研究的核心内容之一，只有在充分了解物种遗传结构与多样性的前提下，才能制定有效的保护策略[3-4].目前，有关三尾凤蝶的研究不多，主要涉及其分布、生物学和生态特性、濒危原因与保护策略等[5-8].诸立新等[9]对尾凤蝶属部分种类的分子系统关系进行研究时曾涉及到三尾凤蝶，并对四川芦山、云南东川和云南高贡山3个种群的COⅠ基因序列差异进行了分析；但尚未见有关三尾凤蝶遗传多样性方面的报道.

线粒体DNA(mitochondria DNA， mtDNA)因其母系遗传、进化速率快、拷贝数多等特点，已被广泛应用于昆虫的系统进化及种群遗传变异研究[10-12].本研究以三尾凤蝶mtDNACOⅠ和ND1基因作为分子标记，对其遗传多样性进行分析，以期为该物种的保护提供基础资料.

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

三尾凤蝶分别采自云南省和四川省，共36头.为方便研究，根据分布地距离，分为3个地理种群.样本采集后，立即将其一侧的中后足取下，放入装有无水乙醇的离心管中并标记，带回实验室，置于-20 ℃冰箱中保存备用，标本信息见表1.

表1 三尾凤蝶样本采集信息

1.2 DNA提取

将足移入1.5 mL的离心管中，加入1 000 μL STE缓冲液，在干式恒温器中37 ℃加热1 h，去除离心管中的缓冲液，重新加入200 μL STE缓冲液；用小剪刀将足剪碎，加入4 mL蛋白酶K；干式恒温器中37 ℃处理5 min，95 ℃加热15 min，每隔5 min震荡一次，待样本温度回到室温后离心(4 000 r·min-1)，-40 ℃冰箱保存待用.

1.3 PCR反应与测序

参照Aubert et al[13]、Simon et al[14]和Sperling et al[15]的方法进行PCR扩增.COⅠ引物序列：(Jerry)COⅠ-F为5′-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3′，(Pat2)COⅠ-R为5′-TCCATTACATATAATCTGCCATATT-3′， (Djernaes)COⅠ-R为5′-GC TATTATAGCATA AATTATTCC-3′；ND1引物序列：ND1-F为5′-ATCAAAAGGAGCTCGATTAGTTTC-3′，ND1-R为5′-CGTAAAGTCCTAGGTTATATTCAGATTCG-3′.反应体系为25 μL:模板DNA 1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL,ExTaqDNA聚合酶0.25 μL,浓度均为2.5 mmol·L-1，10 mmol·L-1dNTP Mix和25 mmol·L-1MgCl2各2.0 μL，10×Loading Buffer 2.5 μL.扩增条件：预变性95 ℃ 3 min，变性94 ℃ 1 min，退火50 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，30个循环，终延伸72 ℃ 5 min.反应结束后，取扩增产物2.4 μL，在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测(电压150 V，电泳缓冲液为0.5×TBE)，在凝胶成像系统下观察并拍照记录.确定成功扩增出目标片断后，送上海赛音生物技术有限公司完成双向测序工作.本研究中COⅠ与ND1所使用反应体系一致.

1.4 数据分析

从NCBI网站中通过BLAST同源检索确认所测样本的COⅠ和ND1基因序列.将校对后的测序结果通过BioEdit 7.0.9软件中的Clustal W功能进行逆向互补校对，并对序列进行手工矫正和剪切；利用MEGA 5.0对整理好的序列进行概念翻译，基于Kimura-2参数对序列特征、群体间遗传距离(P-distance)和遗传差异进行分析[16-17].应用DnaSP 5.0软件分析计算三尾凤蝶各地理种群间单倍型多样性(haplotype diversity,Hd)、核苷酸平均差异数(average number of nucleotide differences,K)、种群间核苷酸平均差异数(average number of nucleotide differences between populations,Kxy)、核苷酸歧义度(average number of nuc. subs. Per site between population,Dxy)、核苷酸多样性(nucleotide diversity,Pi)、固定系数(fixation indices,Fst)、遗传分化系数(coefficient of genetic differentiation,Gst)及基因流(gene flow,Nm)等分子遗传学系数，并对其进行Tajima′sD和Fu′s Fs中性检验[18].参照Clement et al[19]的方法，采用TCS 1.2.1软件对线粒体部分基因序列进行单倍型网络进化分析，构建单倍型网络图，简约上限默认值为95%.

2 结果与分析

2.1 基因特征

去除测序结果两端侧翼序列，得2段三尾凤蝶COⅠ序列，长度分别为658和775 bp，ND1序列长度480 bp，整合COⅠ和ND1序列后，得总长度为1 913 bp. 4种核苷酸的平均含量：T为39.6%，C为13.8%，A为34.7%，G为11.9%.A+T含量为74.3%，表现出明显的A/T碱基偏向性.

2.2 遗传多样性分析

线粒体联合基因序列中，仅TH03、TH04、TH11和TH14样本之间有1～2个碱基位点的变异，其余序列完全相同.共定义5个单倍型，标记为Ha1、Ha2、Ha3、Ha4和Ha5.其中，Ha1出现的频率较高，为云南丽江种群、东川种群和四川种群的共享单倍型；Ha2、Ha3为独享单倍型，仅在云南丽江种群中出现；Ha4、Ha5为四川种群的独享单倍型(表2).共发现4个变异位点，约占全长的0.2%；简约信息位点3个，约占全长的0.16%；自裔位点1个，未发现有核苷酸的替换.核苷酸差异数K为0.390，种群间核苷酸差异数Kxy为0.398 50～0.561 40；核苷酸歧义度Dxy介于0.000 21～0.000 29之间；单倍型多样性Hd为0.218，核苷酸多样性Pi为0.000 2(表3).各地理种群总遗传分化系数Gst为0.059 98，总固定系数Fst为0.059 95，总基因流Nm为3.92.中性检测Tajima′sD值为-1.476 50， Fu′s Fs为-3.059(表3)，差异不显著(P>0.10).多样性分析表明，三尾凤蝶遗传多样性低.

表2 三尾凤蝶不同地理种群线粒体基因单倍型在群体中的分布

表3 三尾凤蝶3种地理种群部分线粒体基因的遗传多样性与中性检验

2.3 遗传分化

2.3.1 遗传距离 采用MEGA 5.0软件基于Kimura-2-Parameter双参数模型，计算三尾凤蝶各地理种群间的遗传距离.结果显示，三尾凤蝶云南和四川各种群间的遗传距离均约为0.000，总体遗传距离为 0.

2.3.2 单倍型网络关系 由TCS软件构建了一个连续的三尾凤蝶单倍型网络图(图1).各单倍型未表现明显的地理区域聚类关系，其中，单倍型Ha1为所有单倍型聚类的起点.

单倍型之间的连接代表突变差异；未标记的节点表示推断出来的突变步骤，且未在样品中实际观察到；回路结构是趋同进化的结果.

3 讨论

对三尾凤蝶线粒体DNACOⅠ和ND1序列分析显示，单倍型少，核苷酸多样性较低，表明三尾凤蝶的遗传多样性低，与诸立新等[9]的结论一致；Fst是表明不同种群间遗传分化的重要参数，其值越大表明种群间的分化程度越高[20].DNACOⅠ和ND1序列Fst为0.059 95，表明三尾凤蝶遗传分化水平较低.遗传距离和基因流表明，各种群间基因交流频繁.

栖息地丧失、退化与破碎化是导致物种消失的根本原因[21-24].栖息地的片断化，导致个体在适宜栖息地斑块间的迁移变得更加困难，种群规模缩小，斑块间基因流减少，种群内部近交和遗传漂变导致遗传多样性下降，从而引起适合度下降，最终导致局部灭绝[22，25-26].物种本身遗传多样性丧失带来的问题也不容忽视.物种遗传多样性高低与其进化潜力、环境适应能力紧密相关，较高的遗传多样性对物种在遭受环境胁迫情况下维持生存繁衍具有重要意义[5,27].本研究显示，三尾凤蝶的遗传多样性低，表明该物种对环境变化的适应能力较弱，生存和进化潜力较小.因此，建议对三尾凤蝶所有种群进行保护.

由小种群入侵迅速扩张建立的种群和进化历史上经历过瓶颈效应的物种往往表现为较低的多样性[28-31].四川和云南分布的三尾凤蝶3个种群遗传多样性较低，推测在其进化历史过程中经历了一次或几次瓶颈效应，现有种群可能由一个小种群建立并扩张而成.诸立新等[9]也认为，三尾凤蝶可能在近期经历过一次瓶颈效应.单倍型网络分析显示，Ha1为所有单倍型聚类的起点，该单倍型可能为三尾凤蝶的祖先类型；该单倍型为四川和云南种群所共享，进一步说明云南和四川分布的三尾凤蝶种群可能起源于一个小的种群，并经历过种群扩张.三尾凤蝶以横断山为中心分布，并延伸到周边地区，分布相对较广，南至缅甸北部，北至甘肃、陕西秦岭，西至西藏东部，东至湖北神龙架和湖南武陵山脉西南端.本研究仅涉及云南和四川种群，整个三尾凤蝶种群遗传多样性状况有待进一步研究.

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(责任编辑:杨郁霞)

Genetic diversity ofBhutanitisthaidinaBlanchard, based on mitochondrialCOⅠ and ND1

ZHAO Jian1, HU Shaoji2, HE Qiuju1, YI Chuanhui3, HE Ju3, FENG Zhiwei3, YANG Jianhua3, CHEN Peng3

(1.Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control in Yunnan Province, Southwest Forestry University, Kunming, Yunnan 650224, China; 2.School of Agriculture, Yunnan University, Kunming, Yunnan 650223, China;3.Yunnan Academy of Forestry, Kunming, Yunnan 650201, China)

Thirty-sixBhutanitisthaidinasamples were collected from 3 geographical populations (YNLJ, YNDC, SC) in Yunnan and Sichuan Provinces, and mitochondrialCOⅠ and ND1 genes were sequenced and analyzed. The results showed that the combined mitochondrialCOⅠ and ND1 fragment were 1 913 bp in length. Base composition of A and T was 74.3%, indicating a strong A+T bias. A total of 4 mutation sites and 5 haplotypes including one shared haploid type (Ha1) were detected. The nucleotide and haplotype diversity were 0.000 2 and 0.218 0. Coefficient of genetic differentiation (Gst), fixation indices (Fst), gene flow (Nm) and genetic distance were 0.059 98, 0.059 95, 3.920 00 and 0, respectively. The results indicated low genetic diversity and an extensive gene flow among differentB.thaidinapopulations， and gene differentiations were not found among all populations.

Bhutanitisthaidina; mitochondria；COⅠ; ND1; genetic diversity; gene differentiation

2016-09-21

2017-05-08

国家自然科学基金项目(31260527);云南省中青年学术技术带头人后备人才项目(2013HB093);云南省森林灾害预警与控制重点实验室开放基金项目(ZK150005).

赵健(1990-)，男，硕士研究生.研究方向:蝴蝶多样性.Email:a540648169@qq.com.通讯作者易传辉(1970-),男,副研究员,博士.研究方向:昆虫生态、资源昆虫培育与利用.Email:ynkcx2007@163.com.

Q963

A

1671-5470(2017)04-0387-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.04.004