柑橘黄龙病碘—淀粉法快速检测技术优化

王许会, 郭洋洋, 全金成, 张宇宏, 陈慈相, 邱栋梁, 毛润乾

(1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2.广东省生物资源应用研究所,广东省动物保护与资源利用重点实验室/广东省野生动物保护与利用公共实验室，广东 广州 510260；3.广西特色作物研究所，广西 桂林 541004；4.江西省赣州市果树植保站/赣南脐橙工程技术研究中心，江西 赣州 341000)



柑橘黄龙病碘—淀粉法快速检测技术优化

王许会1, 郭洋洋2, 全金成3, 张宇宏2, 陈慈相4, 邱栋梁1, 毛润乾2

(1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2.广东省生物资源应用研究所,广东省动物保护与资源利用重点实验室/广东省野生动物保护与利用公共实验室，广东 广州 510260；3.广西特色作物研究所，广西 桂林 541004；4.江西省赣州市果树植保站/赣南脐橙工程技术研究中心，江西 赣州 341000)

为使一种柑橘黄龙病碘—淀粉法快速检测技术更好地应用于大田检测，以砂糖橘为试验材料，研究无需冷冻和缩短叶片脱色时间的技术.结果表明，磨掉叶片正反面表面蜡质层后，直接脱色，可以省去冷冻处理步骤，且不影响检测结果；检测结果与常规PCR检出结果的一致率为92.5%；同时，叶片脱色时间缩短7.17～8.47 h.优化后，冬季样品叶绿素脱除所需时间均值为5.0 h，其他季节叶片脱色时间均值为3.7 h.

柑橘黄龙病; 碘—淀粉法; 快速检测技术; PCR

柑橘黄龙病(citrus huanglongbing),又称为黄梢病、黄枯病，是由一种寄生于植株韧皮部的革兰氏阴性细菌引发的检疫性病害[1].感染该病后，植株会出现典型的斑驳叶、黄梢和“红鼻子果”等症状，病情进一步发展会导致根部腐烂和生长衰弱，最终整株死亡[2];同时，黄龙病可通过苗木、柑橘木虱(Diaphorinacitri)和菟丝子(Cuscutachinensis)在田间快速传播，给柑橘产区造成毁灭性灾难[3-4].

目前，生产上通过及时清除病树、防治柑橘木虱和推广无毒苗等措施来控制黄龙病的扩散，而有效实施这些防控策略的前提是该病的准确检测.在众多黄龙病检测技术中，指示植物鉴定、血清学检测和显微镜观察法由于检出率低且耗时、费力，而很少被采用；田间症状诊断虽准确率低但简便易行，是常用的辅助检测方法；分子生物学检测具有特异性强、灵敏度高和效率高的特点，是当前应用最广、发展最快的一种检测方法，但存在技术要求高和检测成本昂贵等不足[5-7].此外，基于碘—淀粉反应的黄龙病检测技术，由于低成本、低技术要求和较高准确率的特点而成为田间自助检测的主要选择.

基于碘—淀粉反应的黄龙病检测技术主要建立在2个条件之上：(1)感病植株淀粉代谢异常，叶片积累大量淀粉；(2)黄龙病引起植株韧皮部组织坏死和筛管堵塞[8-11].科研人员通过对少量叶样的研磨液染色或直接观察叶样组织染色后的颜色变化来判断植株是否感染黄龙病[12-15]，但这些技术因存在严重的局限性而很难被应用于大田,如需要专门的研磨设备，且健康叶片经光合作用后会有淀粉积累，研磨液染色后也会出现颜色变化而影响病情诊断.毛润乾等[16]在前人研究基础上，采用暗处理技术，排除叶片正常积累的过渡型淀粉和叶片中叶绿素的干扰，建立了一种新黄龙病快速检测技术.该技术提高了检测准确性，并基本实现了农民自检；但仍有一些技术问题需要改进，如叶片脱色时冷冻处理步骤需要冰箱完成，脱色时间较长等.本研究旨在解决快速检测中的冷冻和脱色问题，用砂纸打磨叶片表面腊质层的方法替代剪切叶片和叶片冷冻处理，缩短检测时间，为柑橘黄龙病的准确、快速检测提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 健康柑橘叶片，采自广东省生物资源应用研究所内的砂糖橘树(来源于清远无病苗圃)；感染黄龙病叶片，采自广州萝岗九龙柑橘园，叶片经常规PCR方法确认.

1.1.2 试剂(盒) 植物基因组DNA提取试剂盒、Taq酶、dNTPs、DL2000 DNA maker、6×Loading buffer购自北京天根生化科技有限公司，脱色液和染色液为广东省生物资源应用研究所专利药剂，其他化学试剂均为国产分析纯.

1.1.3 仪器设备 BioMateTM 3 Series紫外/可见光分光光度计，小型台式高速离心机(Sigma，德国)，Mastercycler Ep gradients 梯度PCR仪(Eppendorf，德国)，电热恒温水槽DK-8D型(上海一恒科技有限公司)，电子天平(SHIMADZU，日本)，DGX-9003鼓风干燥箱(上海福玛实验设备有限公司)，超级纯水系统(Barnstead，美国)，高通量组织研磨仪(北京格瑞德曼仪器设备有限公司)，DDY-6C电泳仪(北京市六一仪器厂)，CN-1000凝胶成像系统(Vilber，法国)，DYCP-31DN水平电泳槽(北京市六一仪器厂)，霉菌培养箱(MJP-150)，海尔电冰柜(FCD-270SE).

1.2 方法

1.2.1 原有技术冷冻与脱色时间的测定 采集35片成熟且健康的柑橘叶，厚薄、颜色尽量一致，沿叶脉剪取长4 cm、宽1 cm的叶块作为叶样，以垂直主叶脉的方向将叶样剪为1 mm宽的细条，不剪断主叶脉.将剪好的叶样放入电冰柜中，温度为-15 ℃，冷冻时间设为0、1、2、3、4、5、6 h，每个冷冻处理重复5次.将冷冻后的叶样浸泡在盛有12.5 mL脱色液的离心管中，置于33 ℃霉菌培养箱内；从第4小时开始，每隔1 h观察一次并拍照，直至叶片绿色完全脱去.

1.2.2 技术优化后冷冻与脱色时间的测定 取叶样35片，用砂纸均匀打磨叶片两面，破坏叶片表面的蜡质层.将打磨好的叶样放入电冰柜中，温度为-15 ℃，冷冻时间设为0、1、2、3、4、5、6 h，每个冷冻处理重复5次.将叶样浸泡在盛有12.5 mL脱色液的离心管中，置于33 ℃霉菌培养箱内；每隔1 h观察一次并拍照，直至叶片绿色完全脱去.

1.2.3 不同季节叶片脱色时间的测定 参照广州市2011—2013年的气候资料，选定广州市4个季节的模拟温度.取叶样，用砂纸均匀打磨叶样两面，破坏叶片表面的蜡质层.将打磨好的叶样浸泡在盛有12.5 mL脱色液的离心管中，于霉菌培养箱内脱色，温度按选定的广州市4个季节模拟温度设定，每个温度处理重复5次；每隔1 h观察一次并拍照，直至叶片绿色完全脱去.

1.2.4 PCR检测 叶片DNA提取参照TIANGEN公司的植物基因组DNA提取试剂盒说明书(版本号：DP130227).利用柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA基因序列作靶标，参考Jagoueix et al[17]的方法设计引物OI1/OI2c(目的片段长度1 167 bp)，由华大科技(深圳)公司合成.引物序列：OI1为5′-GCGCGTATCCAATACGAGCGGCA-3′，OI2c为5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′.PCR反应体系：10×PCR缓冲液2 mL，dNTP 2 mL，上、下游引物各0.5 mL，模板1 mL，Taq DNA 聚合酶0.4 mL，加超纯水17.6 mL至总体积25 mL.PCR反应条件：96 ℃变性1 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃ 4 min.PCR扩增完成后取5 μL反应产物与2 μL Loading Buffer混合均匀，然后经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察结果并照相，如在1 167 bp处出现条带，则为阳性样品.

1.3 数据处理

利用SPSS 19.0和Excel 2003软件处理数据，采用Tukey检验方法分析差异显著性.

2 结果与分析

2.1 原有技术冷冻与脱色时间

由图1可知，冷冻0 h，样品叶绿素脱除时间为(20.80±4.02) h，比其他处理时间长，且差异显著(P<0.05)； 1～6 h冷冻处理组，脱色时间为11.6～13.2 h，均值为(12.17±1.26) h，各处理间差异不显著(P>0.05).这说明叶片被剪为细条后，冷冻处理可以缩短叶绿素脱除时间；但冷冻时间的长短，并不影响叶绿素脱除时间.

图中小写字母不同者表示差异显著(P<0.05)，小写字母相同者表示差异不显著(P>0.05，Tukey法).

2.2 优化后的冷冻与脱色时间

由图2可知，冷冻0 h，样品叶绿素脱除时间为(3.80±0.84) h；冷冻1～6 h，脱色时间为3.6～3.8 h，均值为(3.74±0.89) h；7个处理之间差异不显著(P>0.05).这说明打磨叶片表面蜡质层后，脱色不需要冷冻处理.因此，直接用砂纸磨去叶片正反面的蜡质层，然后放入脱色液中脱色，省略了剪切叶片和冷冻处理的环节，达到了技术优化的目的.比较优化前后的叶片脱色时间可知，优化前的平均脱色时间为(12.17±1.26) h，是优化后的3.88倍.因此，优化后还缩短了样品叶绿素脱除时间，使柑橘叶片脱色和黄龙病检测变得更加简便和快速.

图中小写字母相同者表示差异不显著(P>0.05，Tukey法).

年份温度/℃春夏秋冬201122333219201227332916201331342420均值27332818

2.3 不同季节叶片脱色时间

根据对广州市2011—2013年气候资料(表1)的分析，将春季和秋季的模拟温度设为27 ℃，夏季的模拟温度设为33 ℃，冬季的模拟温度设为18 ℃.

在不同温度条件下，采用优化技术脱除柑橘叶片的叶绿素.结果表明，18、27和33 ℃时，叶片叶绿素脱除时间均值分别为(5.00±0.71)、(3.60±0.55)和(3.80±0.45) h；显著性检验显示，18 ℃与27、33 ℃样品叶绿素脱除时间差异显著(P<0.05)，27 ℃与33 ℃样品叶绿素脱除时间差异不显著(P>0.05).因此，温度是影响叶片脱色的因素之一，低温季节叶绿素脱除时间相对较长.柑橘叶片叶绿素脱除时间参考值可定为4～6 h.

2.4 优化技术检测黄龙病效果

采用优化后的检测技术，对柑橘叶片进行显色检测，结果见图3.叶片Ⅰ和Ⅱ采自感染黄龙病的植株(PCR检测确认)，叶片检测结果大部分显示深蓝色，说明检测的准确性较高.叶片Ⅱ脱色前为深绿色，未表现出黄龙病症状(斑驳叶)，PCR确认为黄龙病叶；显色检测后颜色发生变化，叶片大部分显示深蓝色，说明优化技术的灵敏性较高.叶片Ⅲ和Ⅳ采自健康植株，PCR检测确认未染病；显色检测后未发生颜色变化，叶片呈麦黄色.这说明优化技术脱色均匀，脱色效果较好，能消除叶绿素干扰，且该检测技术对于柑橘叶片是否感染黄龙病有很高的区分度.

Ⅰ、Ⅱ为感染黄龙病的叶片；Ⅲ、Ⅳ为健康叶片.叶片在检测前均经过24 h的暗处理.

2.5 优化技术与常规PCR检测的一致性

用优化技术和常规PCR技术2种方法同时对67个柑橘叶片样本的黄龙病进行检测：常规PCR技术检测结果显示，阳性样品54个，阴性13个；优化后显色诊断技术检测结果显示，阳性样品46个，阴性23个.2种检测方法的阳性一致率为90.7%，阴性一致率为100%，总体检测结果的一致率为92.5%.

3 讨论

碘—淀粉法快速检测技术以其便捷、廉价和较高的准确度等优势成为实验室检测之外的首选[18-19].毛润乾等[16]建立的黄龙病检测技术已经以试剂盒的形式在部分柑橘产区得到应用.本研究对其脱色步骤进行优化，既缩短了脱色时间，又省略了冷冻步骤.此外，优化后的检测技术，不仅消除了叶绿素和正常积累的过渡型淀粉的干扰，而且可保证叶片的完整性，提高了检测结果的可重复性；同时，优化后的检测技术用砂纸打磨、破坏叶面的蜡质层，使染色更加均匀、迅速、直观；显色处理还可以较准确地反映异常淀粉在叶片中的积累情况.

黄龙病检测中，如果能将田间症状诊断、碘—淀粉反应检测和分子生物学检测相结合，就能构成良性的互补关系，形成较完整的黄龙病检测体系.基于碘—淀粉反应的黄龙病检测技术必须在柑橘叶片出现淀粉异常积累一定程度后才具有实用性，最佳的使用时期可能是叶片出现轻微斑驳症状，对此还需进一步验证.在黄龙病初期，苗木的诊断仍需用分子生物学检测方法.田间症状检测可以作为辅助诊断方法，以排除因机械损伤、水浸烂根或病虫害引起的淀粉积累而干扰碘—淀粉检测，提高检测的准确性.总之，黄龙病叶片中淀粉的异常积累已得到广泛的证明[9,20-24]，基于碘—淀粉反应的黄龙病检测技术已取得重要应用进展，但在准确度、灵敏度和检测时间方面还有很大的提升空间.

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(责任编辑:杨郁霞)

Optimization of iodo-starch reaction rapid test for detecting citrus huanglongbing

WANG Xuhui1, GUO Yangyang2, QUAN Jincheng3, ZHANG Yuhong2, CHEN Cixiang4,QIU Dongliang1, MAO Runqian2

(1.College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization/Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization, Guangdong Institute of Applied Biological Resources, Guangzhou, Guangdong 510260, China; 3.Guangxi Especial Crops Research Institute, Guilin, Guangxi 541004, China; 4.Station of Fruit Tree Protection of Ganzhou City/Gannan Engineering Research Center for Navel Orange, Ganzhou, Jiangxi 341000, China)

To improve citrus huanglongbing detection method for rapid field test, iodo-starch reaction technology was optimized in terms of frozen time and rubbing leaf epidermis. The results showed that rubbing leaf epidermis was an alternative to frozen treatment without compromising diagnosis accuracy, achieving 92.5% consistency with PCR. So that citrus leaf with rubbed epidermis can be decolorized directly. Averagely, decoloration time was reduced by 7.17-8.47 h, with about 5.0 h saved in winter and 3.7 h in other seasons.

citrus huanglongbing; iodo-starch reaction; rapid detection technology; PCR

2016-12-12

2017-03-01

广东省黄龙病综合防控专项(2014462);广东省科技计划项目(2017B020202005);广东省科学院科技发展专项(2017GDASCX-0107);广西农业科技项目(Z201619);福建农林大学科技推广项目(KH1501970，KN150017A).

王许会(1989-)，女，硕士研究生.研究方向：果树生理生化与生态.Email:1510344924@qq.com.通讯作者毛润乾(1968-)，男，研究员，硕士生导师.研究方向：农业昆虫与害虫防治.Email:maorun@gdei.gd.cn.

Q945.8

A

1671-5470(2017)04-0392-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.04.005