不同配方饲料对DEN诱导小鼠肝癌模型建立的影响

何晓东，郐一贺，黎冰林，邓慧君，李江超，乔梁，王丽京*

(1. 广东药科大学基础学院血管生物学研究所，广州 51006； 2. 澳大利亚悉尼大学肝病研究中心)

研究报告

不同配方饲料对DEN诱导小鼠肝癌模型建立的影响

何晓东1，郐一贺1，黎冰林1，邓慧君1，李江超1，乔梁2，王丽京1*

(1. 广东药科大学基础学院血管生物学研究所，广州 51006； 2. 澳大利亚悉尼大学肝病研究中心)

目的 建立二乙基亚硝胺(DEN)诱导的小鼠肝癌模型并使用两种不同配方饲料：SPF级小鼠大鼠全价配合饲料和AIN93-G配方合成饲料分别喂养，探讨不同饲料喂养对构建DEN诱导小鼠肝癌模型的影响。方法 14日龄雄性C57BL/6小鼠腹腔一次性注射DEN溶液，给药量25 mg/kg体重，建立小鼠肝癌模型。小鼠离乳后分为两组，一组以常规SPF级大小鼠全价配合饲料喂养，另一组以AIN-93G配方合成饲料喂养。模型小鼠生长至9月龄时处死，取肝脏组织称重，观察并记录肝癌生长情况。结果 全价饲料组小鼠肝脏全部产生肿瘤，AIN-93G组小鼠体重和肝脏重量明显低于全价饲料组小鼠，肝癌发生率、肿瘤结节数量和大小也明显低于全价饲料组小鼠。结论 全价饲料喂养的小鼠DEN诱导肝癌模型造模成功，而AIN-93G饲料喂养的小鼠诱导肝癌的发生发展受到抑制，同时小鼠体重明显下降，提示了饮食因素在动物疾病模型建立中起到的关键作用。

饲料；二乙基亚硝胺；肝癌；小鼠

在生命科学领域常常利用实验动物建立研究模型，以模拟人类疾病发生发展的过程。各类疾病动物模型被广泛用来研究人类疾病的发生发展机制、药物筛选以及治疗评价等[1]。选用适合的造模方法和严格规范的操作是建立动物疾病模型的关键。然而，实验动物的自身质量是成功建立动物疾病模型的先决条件。影响实验动物质量的因素是多方面的，如遗传、环境、饮水、饲料等。其中实验动物饲料质量是与实验动物质量密切相关的重要条件，也是保证动物实验顺利进行和实验结果准确可靠的基础[2]。不同饲料对实验动物生长和繁殖性能、生化指标均有不同程度的影响[3，4]，但饲料因素在肿瘤模型建立过程中的作用还未见报道。本研究在建立DEN诱导的小鼠肝癌模型过程中，使用了两种不同配方饲料分别喂养实验小鼠：商品化的SPF级大小鼠全价配合维持饲料和AIN-93G配方合成饲料，探讨使用不同配方饲料喂养对建立DEN诱导的小鼠肝癌模型的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级C57BL/6小鼠雌雄各8只，6～8周龄，体重18～22 g，购自广东省医学实验动物中心【SCXK(粤)2013-0002】。动物实验在广东药科大学实验动物中心屏障环境内进行【SYXK(粤)2012-0125】，并按照3R原则给予人道关怀。

1.1.2 试剂

二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN) 购自美国Sigma公司，产品编号：N0756，浓度为0.95 g/mL。AIN93-G配方合成饲料(AIN93-G饲料)原料及配比为：酪蛋白，200 g/kg；蔗糖100 g/kg；豆油，70 g/kg；纤维素，50 g/Kg；玉米淀粉，397.5 g/kg；麦芽糖糊精，132 g/kg；DL-蛋氨酸，3.0 g/Kg；混合矿物质93-G，35 g/kg；混合维生素93-G，10 g/kg；氯化胆碱，2.5 g/kg。SPF级小鼠大鼠全价配合饲料(全价饲料)主要原料为：玉米、面粉、麸皮、秘鲁鱼粉、豆粕、磷酸氢钙、石粉、植物油、盐、赖氨酸、蛋氨酸、维生素和复合矿物质等。全价饲料为商品化饲料，购自广东省医学实验动物中心，AIN93-G饲料委托广东省医学实验动物中心以SPF级饲料生产标准合成。

1.2 方法

1.2.1 实验小鼠的饲养繁育

将6～8周龄C57小鼠按雄性和雌性1∶1比例合笼配种，每天密切观察配种小鼠状态，准确记录子代小鼠出生日期。所有小鼠饲养于SPF级环境中，以全价饲料喂养；饮用水、垫料经高温高压灭菌，每周更换一次垫料。

1.2.2 DEN诱导小鼠肝癌

子代小鼠成长到14日龄时，从中选择发育正常的雄性幼鼠，称重；DEN原液以1∶600比例用无菌生理盐水稀释，每只雄性幼鼠用胰岛素注射器通过腹腔一次性注射DEN溶液，给药量为25 mg/kg体重，实际注射DEN剂量(1∶600)按以下公式计算：小鼠体重克数 × 16=每只小鼠注射DEN(1∶600) 微升数(μL)。给药后的小鼠放回原笼内继续接受哺乳至离乳。

1.2.3 分笼分组喂养

子代小鼠成长至21日龄后需离乳，雌雄幼鼠分笼，此时将相同年龄并接受过DEN注射的雄性幼鼠分为2组，每组8只，一组继续以全价饲料喂养，另一组以AIN93-G饲料喂养，每周各添加两次饲料，每次约100～150 g。其他饲养条件不变。

1.2.4 肝脏组织取材和HE染色

实验小鼠饲养至9月龄，称体重；脱臼法处死小鼠，剥离肝脏组织，称重，观察肿瘤生长状况并拍照。将肝脏组织于4%多聚甲醛固定液中固定过夜，常规脱水及石蜡包埋。4 μm切片，苏木素伊红染色。于4倍光学显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学方法

使用GraphPad Prism5进行单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 AIN-93G饲料与全价饲料主要营养成分比较

通过对比，AIN93-G饲料实测各主要营养成分含量基本等于或接近配方理论含量；AIN93-G饲料的蛋白质、赖氨酸含量(实测)与全价饲料相当，脂肪含量(实测)略高于全价配合饲料；AIN93-G饲料钙、磷、钠、铁、碘、锰等微量元素含量(实测)略低于全价饲料含量，锌含量基本持平；维生素含量中，全价饲料中维生素A(实测)，K，B1，B2(理论)含量较高，AIN93-G饲料中维生素D含量较高，维生素B6(实测)持平。此外，全价饲料有更高的叶酸含量。

表1 两种饲料营养成分的比较Tab.1 Comparison of nutritional components between the two kind of diets

2.2 AIN-93G饲料对DEN诱导肝癌小鼠体重的影响

两组小鼠于3周龄(0.75月龄)时分笼，此时两组小鼠体重差异无显著性(P> 0.05)；两组小鼠分别以全价饲料和AIN93-G饲料喂养至9月龄，取材前称重，此时AIN-93G组小鼠体重明显低于全价饲料组，差异有显著性(P< 0.001)(图1)。

注：全价饲料组与AIN-93G饲料组体重相比较，***P<0.001。图1 AIN-93G饲料对DEN诱导小鼠体重的影响Note. Compared with the body weight of AIN-93G diet group, ***P<0.001.Fig.1 Effect of AIN-93G diet on the body weight of DEN-treated mice

2.3 AIN-93G配方饲料对DEN诱导小鼠肝重量的影响

分别取两组小鼠肝组织称重，结果显示AIN93-G饲料组小鼠肝重量明显低于全价饲料组，差异有显著性(P< 0.01)(图2A)；通过计算发现，AIN93-G饲料组小鼠肝重比(肝脏重量/体重 × 100%)也明显低于全价饲料组，差异有显著性(P< 0.05)(图2B)

2.4 AIN-93G配方饲料对DEN诱导小鼠肝癌的影响

AIN-93G饲料喂养DEN诱导的小鼠，肝肿瘤结节体积，数量均小于全价饲料组，HE染色显示，AIN-93G饲料组肿瘤区域面积也小于全价饲料组(图3A)。AIN-93G饲料同时影响了DEN诱导小鼠肝癌的发生率，全价饲料组小鼠在9月龄时全部产生肝癌，而AIN-93G饲料组小鼠肝癌发生率仅为37.5%(图3B)。

注： A. 全价饲料组与AIN-93G饲料组肝重量相比较， **P<0.01；B. 全价饲料组与AIN-93G饲料组肝体重比相比较，* P<0.05。图2 AIN-93G饲料对DEN诱导小鼠肝重的影响Note. A. Compared with the liver weight in the AIN-93G diet group, **P<0.01; B. Compared with the liver weight ratio in the AIN-93G diet group,*P<0.05.Fig.2 Effect of AIN-93G diet on liver weight in the DEN-treated mice

注：A. 不同饲料喂养DEN诱导小鼠的肝外观和HE染色(×4)；B. 不同饲料喂养DEN诱导小鼠肝癌的发生率。图3 AIN-93G饲料对DEN诱导小鼠肝癌的影响Note: A.Liver appearance and HE staining histology of DEN-induced mice with different diet；B. Incidence of DEN-induced HCC in mice with different dietFig.3 Effect of AIN-93G diet on liver cancer formation in the DEN-treated mice

3 讨论

本研究在建立DEN诱导的小鼠肝癌模型过程中，意外发现使用不同配方的饲料喂养模型小鼠，小鼠的荷瘤情况发生很大差异。采用常规全价饲料喂养的小鼠，在9月龄时，按照预期成功产生了肝癌，肝表面肉眼可见多个大小不一的白色结节，经HE染色后分析病理结构，确定其为肝细胞癌。而由AIN93-G饲料喂养的模型小鼠，部分肝表面未见肿瘤结节，部分生长肿瘤的小鼠，与对照组相比，结节数量少，体积较小。统计结果显示，AIN93-G饲料喂养的小鼠，并没有全部产生肝癌，产生肝癌的个体中，肿瘤发展程度也明显低于对照组，提示AIN-93G饲料喂养的小鼠肝癌的发生发展受到了抑制。

DEN是一种N-亚硝基有机化合物，具有较强的肝毒性，导致肝细胞DNA损伤突变从而诱发肝癌，与人类肝癌发病过程相近[5]，因此常被用作建立大小鼠肝癌模型的诱导剂[6，7]。在非常幼小的小鼠中，DEN是完全的致癌剂，但在更成熟的个体中，需要额外给予促癌剂，通过多种机制共同作用才能形成肝癌[8]。在多个文献报道中，通常选用14～15日龄雄性小鼠腹腔一次性注射DEN来建立小鼠肝癌模型[9-11]。本研究中采用14日龄雄性小鼠腹腔注射DEN，给药量25 mg/kg体重，常规全价饲料喂养的个体，9月龄时100%产生肝癌，与以往报道结果一致[12]。

AIN-93G饲料配方由美国营养科学学会(American Society of Nutritional Sciences, ASNS)研制开发，是AIN-76A饲料配方的改良型，该配方经过深入研究，能够维持生长期啮齿类动物的长期健康[13]。本实验AIN-93G饲料委托广东省医学实验动物中心根据该配方合成，经测定其主要营养成分基本等于或接近配方理论数据。但在本实验中，经此AIN-93G饲料喂养的小鼠，在肝癌生长受到抑制的同时，小鼠体重明显下降，肝重量也明显低于对照组，在一定程度上说明该饲料对小鼠的营养健康或免疫产生影响。另一方面，通过对比两种饲料营养成分的差异，初步推测AIN-93G饲料中某些成份不利于诱导肿瘤的形成，其中各种微量元素含量普遍低于全价饲料，然而是否微量元素或其他某种未测得成分在其中扮演了具体角色，需要进行更深入的研究。

现在还无法证明，是否由于原材料和加工等因素，使得AIN-93G合成饲料质地硬度不同于全价饲料，造成小鼠采食量产生差异[14，15]，进而造成小鼠营养摄入不足。由于原实验设计初衷仅为造模，并没有考虑饮食因素，因此暂时缺少采食量数据；接下来实验将进一步测定饲料硬度，并记录详细采食量，以排除是否由于采食量减少造成营养摄入不足导致了小鼠体重下降。

本研究的结果证明了在建立实验动物疾病模型过程中，环境因素，尤其是饮食因素起到了关键性作用。适宜的生活环境，合理的饮食是动物实验成功的基础。本研究中并未证实除体重和肝重减轻外，小鼠肝功能是否还有其他变化；小鼠体重的下降与肝癌生长受到抑制是否有直接关系，以及这一现象的原因和意义有待更深入的探讨。

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Effect of different formula diets on mouse model with DEN-induced hepatocellular carcinoma

HE Xiao-dong1, GUI Yi-he1, LI Bing-lin1, DENG Hui-jun1, LI Jiang-chao1, QIAO-Liang2, WANG Li-jing1*

(1. Vascular Biology Research Institute, School of Basic Courses,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China； 2. Storr Liver Centre, The Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney,Westmead NSW 2145 Australia)

Objective To establish a mouse model of diethylnitrosamine(DEN)-induced hepatocellular carcinoma (HCC), and to explore the effects of two different diet formulas on the establishment of DEN-induced HCC model. Methods SPF C57BL/6 mice (8 males and 8 females) were injected intraperitoneally with 25 mg/kg DEN at day 14 to establish a HCC model. The mice were divided into two groups after weaning. One group was fed with the SPF class rodents cereal-based diet, another group was fed with AIN-93G formula diet. The mice were sacrificed at the age of 9 months. The livers were weighed and the growth of liver cancer was observed and recorded. Results All the mice in the cereal-based diet group developed HCC as expected. The body weight and liver mass of the mice in the AIN-93G diet group were significantly lower than that of the cereal-based diet group. The incidence of HCC, and the number and size of tumor nodules were also significantly lower in the AIN-93G diet group than that in the cereal-based diet group. Conclusions DEN-induced HCC model has been successfully established in mice fed with cereal-based diet, while mice fed with AIN93-G diet prevented the development of DEN-induced HCC, and their body weight was decreased significantly, suggesting that dietary factors play a key role in establishment of animal disease models.

Diet; Diethylnitrosamine; Hepatocellular carcinoma; Mice

WANG Li-jing. E-mail: wanglijing62@163.com

广东省医学科研基金(编号：B2014207)。

何晓东(1983-)，男，助理研究员。研究方向：基因工程小鼠疾病模型。E-mail: hexiaodong1234567@163.com

王丽京(1962-)，女，教授。研究方向：肿瘤分子生物学。E-mail: wanglijing62@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017)03-0306-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.03.013

2016-10-14