枯草芽孢杆菌发酵米糠制备活性肽及其抗氧化性评价

罗斌 邱波 谢作桦

摘要[目的]研究枯草芽孢杆菌发酵米糠中蛋白多肽的水解度和抗氧化活性，为米糠的高值化综合利用提供技术参考。[方法]以枯草芽孢杆菌为菌种，研究米糠发酵制备活性肽的条件，并对活性肽的抗氧化活性进行评价。[结果] 当枯草芽孢杆菌接种量5%、发酵时间48 h、发酵温度36 ℃、pH 8时，米糠发酵液中水解度较高，达到了21.74%。枯草芽孢杆菌发酵制备的米糠活性肽具有较强的清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的能力。此外，米糠活性肽分子量主要分布在100～5 000 Da，富含天冬氨酸和谷氨酸，并包含了6种人体必需氨基酸。[结论]枯草芽孢杆菌发酵具有提高米糠功能特性的潜力，可为米糠的高值化利用提供参考。

关键词 米糠；枯草芽孢杆菌；发酵；多肽；抗氧化性

中图分类号 TS21 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）02-0122-03

Abstract[Objective] To study the degree of hydrolysis and antioxidant properties of bioactive peptide from rice bran fermented with Bacillus subtilis， which can apply a new method of comprehensive utilization of rice bran.[Method] B.subtilis was used to prepare active peptide and to evaluate the antioxidant activity of active peptide.[Result] The results showed that the degree of hydrolysis in the fermented solution was as high as 21.74%，when B.subtilis content was 5%，fermented time was 48 h，temperature was 36 ℃ and pH was 8.The peptide of rice bran showed excellent antioxidant properties including clearance abilities of DPPH radical，hydroxyl free radical and superoxide radical.The molecular weight of active peptides from rice bran was mainly distributed in 100-5 000 Da.The peptide included Asp and Glu，as well as six kinds of human essential amino acids.[Conclusion] Fermentation with B.subtilis is potential to improve the functional properties and helpful to increase the value of rice bran.

Key words Rice bran；Bacillus subtilis；Fermentation；Peptide；Antioxidant properties

我國是稻谷生产大国，年产量约为1.85亿t[1]。米糠是稻谷经碾米加工生产精米过程中的主要副产物，占稻谷整体重量的9%左右[2]。米糠含有大量的营养成分，如蛋白质、水溶性多糖、膳食纤维、矿物质、维生素等[3-4]。其中，蛋白质占米糠重量的16%～18%，其氨基酸组成接近联合国粮农组织/世界卫生组织（FAO/WHO）的推荐模式[5]。然而，目前我国的米糠资源利用率低，大部分仍作为饲料，甚至直接被丢弃，造成了资源的浪费和环境污染[1]。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种革兰氏染色阳性菌，常作为生物发酵剂用于豆类蛋白质水解制备氨基酸、多肽和氨类化合物[6-7]。然而，目前鲜有报道将枯草芽孢杆菌用于发酵米糠制备多肽。基于米糠的利用现状和枯草芽孢杆菌水解蛋白的特性，笔者利用枯草芽孢杆菌发酵米糠制备抗氧化肽，以期提高米糠的附加值，为米糠的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料。枯草芽孢杆菌，中国工业微生物菌种保藏管理中心；米糠，来自当地一家大米加工厂，蛋白质含量15.78%，脂肪含量17.84%，水分含量8.24%，灰分含量9.07%。

1.1.2 主要试剂。

DPPH，希格玛公司；邻二氮菲、邻苯三酚，国药集团化学试剂有限公司；盐酸等试剂，均为分析纯，天津市大茂化学试剂厂。

1.1.3 主要仪器。生化培养箱，上海跃进医疗器械厂；pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 发酵菌株种子液的制备。将2环活化的菌种接入50 mL种子培养基（蛋白胨1.0%，酵母浸出物0.5%，氯化钠1.0%）中，37 ℃，120 r/min，培养24 h。

1.2.2 米糠发酵。

以发酵液的水解度为评价指标，研究接种量、发酵时间、发酵温度和pH对米糠发酵制备活性肽的影响。将适量种子液接种至发酵液中，在一定的温度下培养一定时间后，取发酵液进行水解度测定。研究某一变量时，其他因素的条件为接种量5%、发酵时间48 h、发酵温度36 ℃、pH 8。

水解度的测定：通过溶液中游离氨基含量的测定来计算水解度，游离氨基采用TNBS法进行测定[8]。

水解度DH=（Lt-L0）/（ Lmax-L0）×100%

式中，Lt表示发酵一段时间后发酵液中的游离氨基含量；L0表示发酵前溶液中的游离氨基含量；Lmax表示米糠中蛋白完全水解后溶液的游离氨基含量。

1.2.3 米糠活性肽的制备。

将发酵液于4 000 r/min下离心30 min，上清液再进行过滤，冻干后即得到米糠活性肽粉末。

1.2.4 米糠活性肽抗氧化性的测定。

通过考察米糠活性肽对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力，对米糠多肽的抗氧化性进行评价，测定方法参照李艳红[9]的报道。

1.2.5 米糠抗氧化肽氨基酸组成测定。

取10 mg大豆多肽粉末，用10 mL 6 mol/L HCl于120 ℃水解24 h，然后用氨基酸自动分析仪进行检测。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌接种量对米糠发酵产物水解度的影响

由图1可见，随着枯草芽孢杆菌接种量的增大，米糠发酵产物水解度先增大后趋于平缓，当接种量达到5%后，水解度无显著性增长，原因可能是米糠中能被利用的蛋白质已基本上被枯草芽孢杆菌分泌的酶系水解，所以接种量相对米糠达到饱和后再进一步增大，不会起到增加体系水解度的效果。

2.2 发酵时间对枯草芽孢杆菌发酵米糠产物水解度的影响

由图2可见，随着发酵时间的增加，米糠发酵产物水解度起初显著增长，当发酵时间达到48 h后，水解度达到最大值，发酵时间进一步延长对水解度没有明显的影响。发酵后期水解度趋于平缓的原因可能是枯草芽孢杆菌逐步衰亡，分泌的水解酶很少；此外，发酵后期发酵体系的整体环境不利于酶的水解。

2.3 发酵温度对枯草芽孢杆菌发酵米糠产物水解度的影响

由图3可见，随着发酵温度的升高，发酵液的水解度呈现先增大后减小的趋势，当发酵温度为36 ℃时，发酵液中水解度达到最大值。可能的原因是在此温度下，枯草芽孢杆菌的生长速度最快，分泌的蛋白质水解酶最多，因而米糠发酵液中蛋白降解物最多，即水解度值最大。

2.4 pH对枯草芽孢杆菌发酵米糠产物水解度的影响

由图4可见，在pH 6～10时，发酵液水解度随着pH的增加呈现了先增加后降低的趋势，当pH为8时，发酵液的水解度达到最大。此结果可能与枯草芽孢杆菌的最适生长酸碱度和蛋白酶酶解的最适pH有关。

基于上述因素对枯草芽孢杆菌发酵米糠产活性肽的影响结果，该试验选定枯草芽孢杆菌接种量5%、发酵时间48 h、发酵温度36 ℃和pH 8用于枯草芽孢杆菌发酵制备米糠活性肽的工艺条件，经过再次试验，确定在此条件下，发酵液中的水解度为21.74%。此外，该试验在此工艺基础上，对制备得到的米糠活性肽抗氧化活性和氨基酸组成进行评价。

2.5 米糠活性肽的抗氧化活性评价

试验得出，米糠活性肽具有较好的抗氧化活性，其中清除DPPH自由基能力的IC50值为7.53 mg/mL，清除羟自由基能力的IC50值为6.48 mg/mL，清除超氧阴离子自由基能力的IC50值为5.74 mg/mL。因此，枯草芽孢杆菌发酵可作为一种制备米糠抗氧化肽的有效手段。

2.6 米糠活性肽的分子量分布

多肽的分子量分布是影响其活性发挥的重要因素，通过高效液相色谱确定的不同标准肽的出峰时间、面积，以分子量的对数（lnMw）对保留时间作图得到分子量校正曲线方程，如Y=-4.376 8X+45.841，R2=0.989 2。通過高效液相色谱图（图5）可知，米糠活性肽分子量在1 000～5 000 Da的组分占85.30%，分子量在100～1 000 Da的组分占14.70%。

2.7 米糠活性肽的氨基酸组成

多肽的氨基酸组成和含量是影响其活性发挥的重要因素，如Adebiyi等[10-11]研究结果表明，米糠蛋白酶解物的氨基酸组成与其抗氧化活性有很大的相关性；刘志国等[12]则报道米糠ACE抑制肽活性可能与C端的苯环结构有关。该试验采用枯草芽孢杆菌制备的米糠活性肽富含天冬氨酸和谷氨酸。此外，米糠活性肽氨基酸组成丰富，含有6种人体必需氨基酸，分别为蛋氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸（表1）。由此可见，米糠活性肽是一种良好的营养补充剂。

3 结论

该试验研究了枯草芽孢杆菌发酵因素对发酵液水解度

的影响，随着接种量和发酵时间的延长，发酵液水解度先增加后趋于平缓；随着发酵温度和pH的增加，发酵液水解度呈先增加后减少的趋势。在枯草芽孢杆菌接种量5%、发酵时间48 h、发酵温度36 ℃和pH 8的发酵条件下，发酵液水解度达到了21.74%。枯草芽孢杆菌发酵制备的米糠活性肽分子量主要分布在100～5 000 Da，富含天冬氨酸和谷氨酸，包含了6种人体必需氨基酸，且具有较强的清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的能力，是一种颇具潜力的活性肽营养补充剂。

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