超声辅助纤维素酶提取茶粕中茶皂苷的工艺研究

王娅玲 李维峰 桂花

摘要[目的]优化茶粕中茶皂苷的提取工艺。[方法]在纤维素酶作用下，利用超声辅助，通过单因素试验与正交试验，研究料液比、酶解温度、酶解时间、酶的用量等因素对茶皂苷提取得率的影响。[结果]试验表明，茶粕中茶皂苷的最佳提取条件为酶解温度50 ℃，酶添加量0.3%，酶解时间70 min，料液比1∶20（g∶mL），在此条件下茶皂苷提取得率为9.769%。[结论]采用超声辅助纤维素酶提取，可有效提高茶粕中茶皂苷的提取得率。

关键词 纤维素酶；超声波；茶粕；茶皂苷

中图分类号 S789.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）02-0097-03

Abstract[Objective] To optimize the extraction process of tea saponin from seed cake of Camellia oleifera.[Method] The single factor test and orthogonal experiment were performed to study the effects of solidliquid ratio，enzymatic temperature，enzymatic time and cellulase amount on the yield of tea saponin by using ultrasonic and cellulase.[Result] The results showed that the optimized extraction condition was as following：enzymatic temperature 50 ℃，cellulose amount 0.3%，enzymatic time 70 min，solidliquid ratio of 1∶20（g∶mL）. Under such condition the extraction rate of tea saponin was up to 9.769%.[Conclusion] Cellulase and ultrasonic extraction method shows high effectiveness in extracting tea saponin from seed cake of C. oleifera.

Key words Cellulase；Ultrasonic；Seed cake of Camellia oleifera；Tea saponin

油茶（Camellia oleifera Abel）為山茶科茶属常绿小乔木，其种子可榨油供食用，油茶籽榨取茶油后剩余的茶粕，又称为油茶饼、茶枯、茶麸等。当前我国油茶种植面积约368万hm2，年油茶产量30万t，茶粕产量约70万t[1]。茶粕中除了含有一定量的油脂外，还含有茶皂苷、茶蛋白、茶多糖等多种生物活性成分，具有很高的应用价值[2-3]。但目前我国处理茶粕的主要方式是经过简单发酵作为农田肥料或动物饲料，部分出口到国外[4]。茶粕中的生物活性成分没有得到充分的开发利用。

茶粕中含有10%～16%的茶皂苷[5]。茶皂苷具有乳化、分散、发泡和去污等性能，并具有抑菌、抗癌、止咳平喘、消炎止痛等药理作用[6-8]，应用范围十分广泛。从茶粕中提取茶皂苷，原料来源丰富，价格低廉，并且能提高茶粕的利用价值，对提高油茶种植产业经济效益具有重要的现实意义。

目前对茶皂苷的提取国内外都有较为深入的研究，提取方法主要包括水提法、碱提酸沉法、乙醇提取法等[9-13]，其中利用一定浓度的乙醇提取茶皂苷是较为常用的方法，但传统的醇提工艺对茶皂苷的提取率较低，限制了茶粕中茶皂苷提取工艺的推广。为提高茶皂苷的提取率，笔者先对茶粕进行纤维素酶水解预处理，再利用超声波辅助醇提法探讨纤维素酶用量、酶解温度、酶解时间、料液比等因素对茶皂苷提取率的影响，为进一步优化茶皂苷提取工艺提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 原料：茶粕取自云南淳普油脂有限公司，茶粕干燥后粉碎过40目筛，石油醚回流5 h去除残余茶籽油，挥干石油醚，残渣105 ℃继续烘干，置于干燥器中备用。

主要试剂：茶皂苷标准品，国家标准物质中心；纤维素酶（活力单位≥50 000 U/g），上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国药集团分析纯。

主要仪器：FW-200万能粉碎机，上海科导SK18-E超声清洗仪，上海精科UV759紫外-可见分光光度计，梅特勒AL204电子分析天平，上海一恒DZF-6053真空干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 样品茶皂苷的提取。

准确称取2 g茶粕样品，加0.1 mol/L pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液5.0 mL[14-15]，加入一定比例的纤维素酶，于不同温度下保持一定时间，再沸水浴5 min进行酶灭活，然后加入一定体积乙醇溶液，使浸提液乙醇浓度达到60%[15-16]，超声30 min，超声功率600 W，超声温度50 ℃[16]，得到茶皂苷提取液。

1.2.2 标准曲线的绘制。茶皂苷含量的测定采用香草醛-浓硫酸法[17]，配制2 mg/mL茶皂苷标准溶液，分别取茶皂苷标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于具塞比色管中，加80%乙醇分别将体积补充至1.0 mL，再分别加入8%香草醛溶液1.0 mL， 77%硫酸溶液8.0 mL，摇匀，置于60 ℃水浴中加热20 min，然后在冰水浴中冷却10 min，取出置于室温。以试剂为空白，在最大吸收波长（550 nm）下测定吸光度，以吸光度对浓度绘制标准曲线，得到回归方程A=9.688x-0.008 6，相关系数R2=0.999 1。

1.2.3 单因素试验。以60%乙醇为提取溶剂，在其他条件相同的情况下，分别考察不同比例的纤维素酶（0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、不同酶解温度（20、30、40、50、60、70 ℃）、不同酶解时间（20、30、40、50、60、70、80、90、100 min）和不同料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶ml）]对茶皂苷提取得率的影响。

1.2.4 正交试验设计。

为对提取工艺进行优化，在上述单因素试验基础上，选择纤维素酶加入量、酶解温度、酶解时间和料液比4个因素按照L9（34）设计4因素3水平试验（表1）。

1.2.5 样品茶皂苷提取得率分析。

取1.0 mL茶皂苷提取液于25 mL比色管中，分别加入8%香草醛溶液1.0 mL，77%硫酸溶液8.0 mL，摇匀，置于60 ℃水浴中加热20 min，然后在冰水浴中冷却10 min，取出置于室温。以试剂为空白，在最大吸收波长（550 nm）下测定吸光度，利用回归方程计算提取液中茶皂苷含量，并按照以下公式计算茶皂苷提取得率。

茶皂苷得率（%）=（提取液中茶皂苷质量/原料质量）×100%

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶添加量对茶皂苷提取的影响。

从图1可以看出，随着纤维素酶用量的增加，茶皂苷的得率逐渐上升，在添加量达到0.3%时达到最大值，茶皂苷得率为8.98%。继续增加酶用量，茶皂苷得率不再增加。因此，纤维素酶的最佳用量为0.3%。

2.1.2 酶解温度对茶皂苷提取的影响。

在纤维素酶添加量为0.3%，pH 5的条件下对茶粕预处理，酶解温度分别设定为20、30、40、50、60、70 ℃，酶灭活后进行超声辅助提取30 min，提取结果见图2。从图2可见，酶解温度对酶预处理茶粕提取茶皂苷影响较大，当温度达到40 ℃时，茶皂苷的得率达到最大。随着温度的进一步提高，茶皂苷得率逐渐下降，究其原因，主要是由于温度过高影响了酶的活性，使酶的有效性降低。因此，酶解温度控制在40 ℃为最佳。

2.1.3 酶解时间对茶皂苷提取的影响。

从图3可见，在酶作用初期，随着酶解时间延长，茶皂苷得率逐渐升高，在酶解时间为70 min时，茶皂苷得率最高，之后随着时间的延长，茶皂苷的得率逐渐下降。其原因是随着细胞壁的分解，茶叶中糖类、蛋白质等可溶性物质随着时间的延长浸入溶液，在测定茶皂苷时干扰了测定，这也会增加后期茶皂苷净化的难度。因此，可认为70 min为最佳酶解时间。

2.1.4 料液比对茶皂苷提取的影响。

由图4可以看出，料液比直接影响茶皂苷的得率，料液比中溶剂用量小不利于茶皂苷的提取，因为溶剂体积过少，茶皂苷从样品中扩散到溶剂中的速率低，而且极易达到饱和状态；当料液比达到1∶15时，茶皂苷得率达到最大值，继续增大料液比中溶液的用量，茶皂苷得率在8.8%左右波动，而且料液比中溶剂用量过大，会在加热过程中造成能量的浪费。综合考虑，选用1∶15为最佳料液比。

2.2 茶粕中茶皂苷提取工艺的正交试验结果

以茶皂苷得率为评价指标，使用正交设计助手 Ⅱ 进行数据统计分析，试验结果见表2。

从表2中可以看出，茶皂苷的提取得率受到酶添加量、酶解温度、酶解时间和料液比4个因素的交叉影响，通过极差R值的比较可以看出，影响茶皂苷提取率因素的主次顺序依次为料液比、酶添加量、酶解温度、酶解时间，茶皂苷的超声辅助生物酶法提取最佳条件是A3B2C2D3，即酶解温度为50 ℃，酶添加量为0.3%，酶解时间为70 min，料液比为1∶20（g∶mL）。

2.3 最佳條件组合试验

根据正交试验优化条件，按照酶解温度50 ℃，酶添加量0.3%，酶解时间70 min，料液比1∶20（g∶mL），超声辅助提取茶皂苷，进行5次平行提取试验，结果提取率依次为10.092%、9.554%、9.461%、9.784%、9.952%。

试验表明，在上述最佳提取工艺下，采用超声辅助纤维素酶法提取茶粕中茶皂苷，平均得率为9.769%，试验结果平均标准误（RSD）为0.118%。

3 结论

该研究采用超声辅助纤维素酶法提取茶粕中茶皂苷，通过单因素试验和正交优化试验研究了茶皂苷的提取最佳工艺，并通过试验验证最佳工艺下茶皂苷的得率，发现在酶解温度为50 ℃，酶添加量为0.3%，酶解时间为70 min，料液比为1∶20（g∶mL）的条件下，采用60%乙醇浸提，超声功率600 W，超声温度50 ℃，超声辅助提取30 min，茶皂苷平均得率可以达到9.769%。该工艺耗时短，提取分离简单，得率较高，具有很高的实际生产应用价值。

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