部分鸡场致病性葡萄球菌的分离·鉴定·药敏试验

钱昌银 胡晓苗

摘要 [目的]从合肥地区部分养鸡场病鸡组织中分离葡萄球菌，并对其进行鉴定和药敏试验。 [方法] 从合肥地区部分养鸡场病鸡组织中分离葡萄球菌，并通过形态特征观察、溶血性试验、血浆凝固酶试验、生化试验对其进行鉴定，最后对其进行药敏试验。[结果]共分离到9株葡萄球菌。经鉴定，其中4株为金黄色葡萄球菌，在临床分离的葡萄球菌中为优势群株；在凝固酶阴性葡萄球菌中2株为头状葡萄球菌，孔氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌和沃氏葡萄球菌各1株。这说明金黄色葡萄球菌是合肥地区家禽养殖场中葡萄球菌類疾病的主要病原菌。药敏试验结果表明，所有分离菌株对12种临床常用抗生素均呈不同程度的耐药性，对青霉素、复方磺胺甲噁唑和恩诺沙星有较高的耐药性。凝固酶阴性葡萄球菌与金黄色葡萄球菌在抗药性方面存在差异。[结论] 在用抗生素防治葡萄球菌病时需通过药敏试验进行药物筛选。该研究结果可为养鸡场用药提供参考。

关键词 葡萄球菌；分离；鉴定；耐药性；药敏试验

中图分类号 S852.61 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0111-03

Isolation，Identification and Drug Sensitivity of Pathogenic Staphylococcus in Some Chicken Farms

QIAN Chang-yin1，HU Xiao-miao2

（1.Hefei Animal Disease Prevention and Control Center， Hefei， Anhui 230601；2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract [Objective] To isolate and identify staphylococcus in some chicken farms of Hefei，and make drug sensitivity test. [Method] Staphylococcus was isolated from some chicken farms of Hefei and the isolated strains were identified by morphological observation， haemolytic test，plasma coagulase test and biochemical tests. And drug sensitivity test was made. [Result] 9 strains of staphylococcus were isolated. 4 strains of them were identified as Staphylococcus aureus， which was dominant strains. Among negative staphylococcus strains in plasma coagulase test， there were 2 strains of Staphylococcus capitis， one strain of Staphylococcus cohnii， Staphylococcus simulans， Staphylococcus warneri. These results showed that Staphylococcus aureus were main pathogen that caused Staphylococcus diseases in chicken farm of Hefei City. The drug sensitivity test results showed that all strains showed different tolerance to 12 common clinical antibiotics. All isolated strains showed higher drug tolerance to penicillin， compound sulfamethoxazole， enrofloxacin. The negative strains in plasma coagulase test and Staphylococcus aureus had difference drug tolerance. [Conclusion] Drugs should be screened out for preventing and controlling staphylococcus by drug sensitivity test. The research results can provide references for the drug administration in chicken farms.

Key words Staphylococcus；Isolation；Identification；Drug tolerance；Drug sensitivity test

葡萄球菌感染鸡后能引起关节炎、皮肤（包括翼尖）坏死、急性败血症状和雏鸡脐炎等。该病常年发生，在高温高湿环境中最易发病，雏鸡和中雏感染葡萄球菌后死亡率最高，是养鸡业中危害严重的疾病之一[1]。鸡表皮或黏膜损伤、机体抵抗力弱和饲养管理不善时，处于金黄色葡萄球菌污染环境下，则容易感染金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌病在各类动物之间可以传播，容易引起交叉感染[2]。Wendlandt等[3]对某农场菌群的调查发现，同一种金黄色葡萄球菌株能在人、鸡、环境之间相互传播，同时同一环境中又存在多种金黄色葡萄球菌菌株。笔者从合肥地区部分养鸡场病鸡组织中分离葡萄球菌，通过形态特征观察、溶血性试验、血浆凝固酶试验、生化试验等对其进行鉴定，最后通过药敏试验检测其对12种常用抗生素的耐药性。

1 材料与方法

1.1 病料来源

病料为合肥地区部分养鸡场提供的病鸡组织。

1.2 葡萄球菌的分离及形态特征观察

无菌条件下取出肝脏组织，用无菌剪刀剪出1个切面，在TSB琼脂平板上涂布，37 ℃下培养24 h，观察并记录菌落特点，并对分离菌株进行革兰氏染色，在油镜下观察，取单克隆转至TSB琼脂平板进行纯化，观察菌落生长情况。

1.3 溶血性试验

挑取细菌接种在兔血平板上，置于37 ℃恒温箱中生长24 h，观察菌落外周是否产生透明的溶血环。

1.4 血浆凝固酶试验

取新鲜兔血浆和生理盐水各1滴，分别滴于载玻片上，用移液枪分别吸取1滴菌液与兔血浆和生理盐水混合，若混合液中有颗粒形成，而对照混合液中没有发生自凝现象者为阳性。

1.5 生化试验

1.5.1

微量生化管培养特性鉴定。包括糖（醇）发酵试验、精氨酸双水解酶试验、七叶苷、V-P试验、脲酶试验。

1.5.2 明胶液化试验。

取大量纯培养的菌液穿刺接种到明胶培养基内，刺入约2/3深度，37 ℃下培养7 d，每隔24 h取出置于4 ℃下20～30 min后，观察结果。

1.5.3 接触酶试验。用接种环从普通平板上挑取单个菌落于载玻片上，滴1滴3%过氧化氢溶液，在30 s内出现大量气泡的是阳性，不产生气泡的为阴性。

根据以上鉴定的生化特性，对分离到的葡萄球菌进行葡萄球菌菌属鉴定[4]。

1.6 药敏试验

选用临床上常用的头孢曲松、左氧氟沙星、青霉素、红霉素、万古霉素、复方磺胺甲噁唑、克林霉素、利福平、新霉素、氟苯尼考、磷霉素、恩诺沙星12种抗生素的药敏片，根据美国CISI操作手册和《全国临体检验操作规程》2006年第2版，依据Bauer和Kirby的纸片扩散法进行药敏试验。药敏试验结果的判定标准见表1。

2 结果与分析

2.1 形态特征观察及溶血性试验结果

经筛选，共分离到9株细菌。对分离到的9株细菌进行革兰氏染色，然后在光学显微镜油镜下观察，可见菌体呈紫色、球形、不规则葡萄串状排列，确定为葡萄球菌。对分离菌株进行编号，分别为1～9。9株分离株在TSB琼脂平板和兔血平板上培养，其菌落直径、形态、颜色、耐盐程度、溶血性等如表2所示。

2.2 生化试验及菌种鉴定结果

根据葡萄球菌的生化特性，采用微量试管培养法对所有分离菌株进行了鉴定，结果见表3。

经鉴定，4株分离菌株（1、3、4、5号）为金黄色葡萄球菌，2号菌株为模仿葡萄球菌，6号菌株为沃氏葡萄球菌，7号、8号菌株为头状葡萄球菌，9号菌株为孔氏葡萄球菌。

2.3 药敏试验结果

由表4可知，分离菌株的耐药能力存在差异，对左氧氟沙星、红霉素、克林霉素、利福平、青霉素、复方磺胺甲噁唑、恩诺沙星耐药，对磷霉素、万古霉素高度敏感。

3 结论与讨论

3.1 家禽葡萄球菌的类型分析

笔者从安徽合肥地区部分鸡场的病鸡组织中共分离到9株葡萄球菌，经鉴定属于以下5种葡萄球菌：金黄色葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、头状葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌。除金黄色葡萄球菌其他4种均为凝固酶阴性葡萄球菌，5种都具有溶血性。金黄色葡萄球菌的检出率最高，说明金黄色葡萄球菌是目前合肥地区家禽养殖场感染的主要病原菌。

3.2 分离的葡萄球菌具有较高的耐药性

近年来养殖业普遍使用抗生素，逐渐增强了葡萄球菌的耐药能力，多重耐药菌株日益增多。邢志广等[5]研究发现金黄色葡萄球菌对万古霉素、利福平、氯霉素敏感，而对青霉素、复方新诺明等药物耐药。朱德姝等[6]研究发现金黄色葡萄球菌对磺胺甲噁唑-甲氧苄啶和磷霉素敏感，而凝固酶阴性葡萄球菌对利福平和磷霉素敏感。该研究中药敏试验结果表明，合肥地区养鸡场流行的葡萄球菌对头孢曲松、万古霉素、新霉素、磷霉素较敏感，可作为合肥地区养鸡场治疗葡萄球菌感染疾病的参考用药。此外，不同鸡场来源的葡萄球菌菌株对临床常用的抗生素耐药情况差异较大，說明不同养鸡场葡萄球菌感染需按所在养殖场药敏试验结果进行治疗。

参考文献

[1] 于福秋.雏鸡肿头型葡萄球菌病的诊断与治疗[J].中国畜牧兽医文摘，2015，31（12）：207-208.

[2] ELASHKER M，GWIDA M，TOMASO H，et al.Staphylococci in cattle and buffaloes with mastitis in Dakahlia Governorate，Egypt [J].J Dairy Sci，2015，98（11）：7450-7459.

[3] WENDLANDT S，KADLEC K，FEβLER A T，et al.Transmission of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates on broiler farms[J].Vet Microbiol，2013，167（3/4）：632-637.

[4] 周庭银.临床微生物学诊断与图解[M].3版.上海：上海科学技术出版社，2012：101-107.

[5] 邢志广，孙文萱，周位强，等.葡萄球菌属的分离鉴定与耐药性监测[J].中华医院感染学杂志，2007，17（7）：881-884.

[6] 朱德姝，汪复，胡付品，等.2010年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志，2011，11（5）：321-329.