加味丹参饮对大鼠心肌缺血再灌注损伤SSAT活性的影响

任婷 饶春梅 成细华 杨胜辉 孙彦波 陈聪 彭霞 黄政德

摘要：目的 观察加味丹参饮对SD大鼠心肌缺血再灌注损伤（IRI）模型精脒/精胺乙酰转移酶（SSAT）/多胺通路的影响，探讨其抗IRI的机制。方法 结扎大鼠冠状动脉左前降支30 min再灌注90 min建立大鼠心肌IRI模型。实验大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组和加味丹参饮组，每组10只。TTC染色测定大鼠心肌梗死面积，ELISA检测大鼠心肌组织SSAT含量，RT-PCR和Western blot分别检测大鼠心肌组织SSAT mRNA和蛋白表达，HPLC检测大鼠心肌组织多胺（腐胺、精脒、精胺）含量。结果 与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死面积、SSAT含量增加，SSAT mRNA和蛋白表达升高，多胺含量降低（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，加味丹参饮组大鼠心肌梗死面积、SSAT含量减少，SSAT mRNA和蛋白表达降低，多胺含量升高（P<0.05，P<0.01）。结论 加味丹参饮可能通过调节SSAT/多胺通路，增加心肌细胞多胺含量，从而对大鼠心肌IRI发挥保护作用。

关键词：加味丹参饮；心肌缺血再灌注损伤；多胺；精脒/精胺乙酰转移酶；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.015

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）07-0062-04

Abstract： Objective To observe the effects of modified Danshen Decoction on spermidine/spermine acetyltransferase （SSAT） /polyamine pathways of SD rats with IRI； To investigate its protective mechanism. Methods The model of IRI was established by ligating left anterior descending coronary artery for 30 min followed by reperfusion for 90 min. The SD rats were randomly divided into the control group， sham-operation group， model group and modified Danshen Decoction group， with 10 rats in each group. The myocardial infarction size was measured by using TTC staining. The contents of SSAT were measured by ELISA. The SSAT mRNA and SSAT protein expression level were detected with real-time fluorescent quantitative PCR method and Western blot， respectively. The contents of polyamines （putrescine， spermidine， spermine） in cardiac tissue were detected by HPLC. Results Compared with sham-operation group， the myocardial infarction size， the SSAT content， the SSAT mRNA and SSAT protein expression levels of model group increased significantly， the contents of polyamines decreased significantly， with statistical significance （P<0.01）； Compared with model group， the myocardial infarction size of modified Danshen Decoction group was significantly reduced， while the SSAT content and SSAT mRNA and protein expression level decreased significantly， the contents of polyamines increased， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Modified Danshen Decoction can adjust the SSAT polyamine pathways and increase polyamine content in cardiomyocytes， and thus play a role of protection of myocardial ischemia-reperfusion injury.

Key words： modified Danshen Decoction； myocardial ischemia/reperfusion injury； polyamines； spermidine/ spermine acetyltransferase； rats

近年來，随着血运重建技术的广泛开展，心肌缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）机制及心肌保护的研究成为倍受重视的课题，但IRI所涉及机制复杂，目前尚未清楚，临床上仍缺乏针对心肌保护的药物。多胺（腐胺、精脒和精胺）是存在于真核细胞且含高密度正电荷的一类有机小分子，广泛参与胚胎发育、细胞生长与分化、细胞程序性凋亡及基因表达调控等重要的生理病理过程[1]。研究发现，多胺系统在IRI发挥重要作用[2]。在IRI时，多胺代谢失衡，多胺分解代谢的限速酶——精脒/精胺乙酰转移酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase，SSAT）表达改变，腐胺生成增多而精胺、精脒减少[3-4]，均与IRI密切相关。本课题组前期研究发现，益气活血中药复方加味丹参饮对防治心肌IRI有重要作用[5-7]。本研究在此基础上，采用SD大鼠制作IRI模型，观察加味丹参饮预处理对大鼠IRI后SSAT表达和活性及多胺含量变化的影响，从SSAT/多胺分解代谢调控角度进一步探讨该方抗心肌IRI机制，为防治心肌IRI寻找新的靶点和药物。

1 实验材料

1.1 动物

清洁级SD大鼠100只，雌雄各半，8～10周龄，体质量220～300 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SYXK（湘）2013-0005。饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，温度18～25 ℃、湿度50%～60%，正常光照，自由摄食饮水。

1.2 药物

加味丹参饮（丹参20 g、檀香6 g、赤芍10 g、川芎6 g、当归6 g、红花6 g、生地黄12 g等），饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，药物混匀，浸泡30 min，水煎2次（檀香后下），合并煎液，过滤，浓缩至1 g原药材/mL。

1.3 主要试剂与仪器

腐胺、精脒、精胺（美国Sigma公司），ELISA试剂盒（Clod-Clone Corp公司），RevertAid? H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司），Trizol试剂（Invitrogen公司），反转录试剂盒（Taka-Ra公司），SYBR GreenPCR Master Mix（美国ABI），引物（上海生工生物工程技术服务有限公司），BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），兔抗大鼠SAT1一抗（Bioss公司），β-actin一抗（Santa cruz公司），HRP耦联山羊抗兔IgG（美国Sigma公司）。小动物呼吸机（浙江大学医学实验仪器厂，DH-8型），十六导生理记录仪（Biopac公司，MPl50型），RT-PCR仪（美国ABI公司，7900型），水平电泳槽（北京君意东方仪器公司，JY-SPC），电泳仪（北京鼎国生物技术发展中心，DG-Ⅲ），紫外凝胶检测和成像系统（BIO-RAD，美国），高速冷冻离心机（美国Sigma公司）。

2 实验方法

2.1 造模

参照文献[3]方法进行造模。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，切开气管，连接小动物呼吸机行人工通气，于第3、4肋间开胸暴露心脏，于冠状动脉左心室前降支离左心耳下缘约0.15 cm处绕左心室支穿线结扎，缺血30 min后剪开结扎线，再灌注90 min，造成心肌IRI。假手术组冠状动脉穿线不结扎。术中连续监视心电图Ⅱ导联的变化，以ST段抬高，T波高耸、倒置或左心室变为苍白色为心肌缺血结扎成功（心肌缺血）的标志，剪开结扎线后ST段回落50%以上、高耸T波下降或左心室由苍白变为暗红色表示再灌注成功。

2.2 分组与给药

实验大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组和加味丹参饮组，每组10只。加味丹参饮组每日给予加味丹参饮7.74 g/kg灌胃[8]（按人和动物间体表面积等效剂量换算），于末次灌胃1 h后建立IRI模型。正常对照组、假手术组和模型组均予等量生理盐水灌胃。灌胃体积均为7.74 mL/kg，每日2次，连续14 d。

2.3 指标检测

2.3.1 TTC染色测定心肌组织梗死面积 再灌注结束后取下心脏，剪除左心室以外心肌组织，置于-20 ℃冰箱冰冻10 min后切片，每片厚约1 mm，放入1%TTC PBS（pH 7.4）中，37 ℃水浴箱中孵育20 min，振荡染色液，使之与心肌充分接触。终止染色后将切片置于10%甲醛溶液中固定过夜。数码相机拍照，存活心肌呈砖红色，梗死区呈灰白色。应用Imagemaster VDS图像分析仪分析心肌梗死面积占心肌总面积的百分比。心肌梗死面积率（%）=所有切片梗死面积之和÷心肌总面积之和×100%。

2.3.2 ELISA检测心肌组织精脒/精胺乙酰转移酶含量 再灌注结束后取大鼠左心室肌组织，用预冷PBS冲洗后加入5 mL PBS，于玻璃匀浆器冰上充分研磨，匀浆液5000 r/min离心5 min，取上清液，按ELISA试剂盒说明书测定SSAT含量。

2.3.3 RT-PCR检测心肌组织精脒/精胺乙酰转移酶mRNA表达 再灌注结束后取大鼠左心室组织，参照Trizol试剂盒方法提取总RNA，取2 μL RNA稀释后，在紫外分光光度仪上测定样品RNA纯度及浓度。以总RNA为模板，按反转录试剂盒合成cDNA，取上述所得cDNA按25 μL体系，RT-PCR仪进行扩增。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，循环40次。反应结束后读取Ct值，通过融解曲线监测各样本PCR反应的特异性，以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法进行数据分析，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt给药组-ΔCt对照组，差别倍数=2-ΔΔCt，其中正常对照组数值设为1。PCR引物序列SSAT正义5'-AAAGGCACTGTCTTGCCACT-3'，反义5'-GTGGCTGGACGGATCTTAAA-3'，产物长度231 bp；β-actin正义5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'，反义5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'，产物长度228 bp。

2.3.4 Western blot检测心肌组织精脒/精胺乙酰转移酶蛋白表达 取大鼠左心室心肌组织，加入预冷全细胞裂解液，于液氮内研磨，将匀浆冰上处理30 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，提取胞浆总蛋白，BCA法测定上清液蛋白含量，置于-80 ℃备用。取胞浆蛋白，加入上样缓冲液，于100 ℃水中煮5 min，每孔40 μg蛋白上样，经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，电转至PVDF膜，取膜后置于含5%脱脂奶粉封闭液中封闭1 h，加SSAT或β-actin一抗（按1∶500稀释于一抗稀释液中），4 ℃孵育过夜；TBST洗膜后加HRP标记羊抗兔IgG室溫孵育1 h；TBST洗膜后显色，凝胶成像系统拍照，计算条带吸光度值。SSAT蛋白表达以其与β-actin内参蛋白吸光度比值表示。

2.3.5 HPLC测定心肌组织多胺含量 参照文献[9]方法。再灌注后取左心室组织约150 mg，加0.3 mmol/L冷高氯酸，冰水浴中制成匀浆，3500 r/min离心10 min，取上清液400 μL，加入内标（1，6-己二胺）10 nmol混匀，加2 mol/L NaOH 2 mL、苯甲酰氯 10 μL，振荡5 min，40 ℃水浴30 min后，加氯仿2 mL，振荡2 min，2000 r/min离心10 min，取1.5 mL氯仿层，加2 mL流动相，振荡，离心，再吸取氯仿层，加热挥干，残余物溶于300 μL甲醇，取10 μL，HPLC分析多胺。固定相为Hypersil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-双蒸水（V∶V，65∶35），柱温 35 ℃，流速0.4 mL/min，紫外检测波长229 nm，AUFS 0.04。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用方差分析，方差不齐采用非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 加味丹参饮对模型大鼠缺血再灌注心肌梗死面积的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠心肌梗死面积率显著增加（P<0.01）；与模型组比较，加味丹参饮组大鼠心肌梗死面积率显著降低（P<0.01）。结果见表1。

4.2 加味丹参饮对模型大鼠心肌组织精脒/精胺乙酰转移酶含量的影响

与正常对照组比较，假手术组大鼠心肌组织SSAT含量无明显变化，模型组大鼠心肌组织SSAT含量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，加味丹参饮组大鼠心肌组织SSAT含量显著降低（P<0.01）。结果见表2。

4.3 加味丹参饮对模型大鼠心肌组织精脒/精胺乙酰转移酶表达的影响

与正常对照组比较，假手术组大鼠心肌组织SSAT mRNA和蛋白表达无明显差异，模型组大鼠心肌组织SSAT mRNA和蛋白表达显著增加（P<0.01）；与模型组比较，加味丹参饮组SSAT mRNA表达显著降低（P<0.01）。结果见表3、图1。

4.4 加味丹参饮对模型大鼠心肌组织多胺含量的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠心肌组织精胺合成减少（P<0.05），腐胺合成增加（P<0.01），精脒变化较小，总多胺池减少（P<0.05）；与模型组比较，加味丹参饮组腐胺合成减少（P<0.05），精胺和总多胺池含量增加（P<0.05）。结果见表4。

5 讨论

多胺具有众多生理功能，并在许多病理过程中发挥作用，多胺能抑制内毒素诱导小鼠血清中炎症介质的释放；在心肌缺血和心肌肥大的细胞凋亡中均发挥重要作用。目前已知肿瘤发生、应激、心肌肥大、心肌重构、脑缺血等许多病理事件的发生与细胞内多胺代谢失衡有关，心肌IRI时多胺代谢失衡，鸟氨酸脱羧酶及SSAT的活性改变[10]。SSAT为多胺代谢限速酶，SSAT催化精胺逆转化为精脒及精脒逆转化为腐胺的过程。SSAT使腐胺生成增多而精胺、精脒减少，将导致继发性的心肌损伤。SSAT过表达老鼠表现出多胺降解增加，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和CYP450表达下降，导致过氧化氢生成增加[11]，可见影响SSAT活性则可影响多胺含量变化，从而对心肌组织IRI产生影响。调控SSAT表达可能对于IRI具有潜在的治疗价值。

本实验结果发现，缺血再灌注时SSAT含量显著增加，SSAT mRNA和蛋白表达均显著升高。同时发现SSAT表达升高后，腐胺含量增加和精脒、精胺、总多胺池含量减少，表明心肌组织IRI可能诱导多胺代谢过程产生应激反应，多胺分解代谢酶SSAT表达升高。SSAT腐胺生成增多而精胺、精脒减少，将导致继发性的心肌损伤[12]。

我们前期实验结果显示，加味丹参饮对IRI心肌有明显的延迟保护作用[5-7]。本研究结果显示，加味丹参饮预处理大鼠心肌IRI模型后，SSAT mRNA和蛋白表达均显著降低，SSAT含量显著减少，提示加味丹参饮可能通过调节SSAT/多胺分解代谢，减少IRI后腐胺生成，从而发挥抗IRI保护作用，但具体机制尚待进一步研究。

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（收稿日期：2016-09-29）

（修回日期：2016-10-31；编辑：华强）