丹皮酚与钙粘素相互作用的分析研究

许凤杰++彪林海++祖元刚++刘志国

摘要丹皮酚对多种肿瘤细胞具有抑制作用，而钙粘素是与肿瘤产生和恶化密切相关的一类糖蛋白。本研究运用荧光光谱法和原子力显微技术探索了丹皮酚与钙粘素的相互作用。荧光光谱法研究结果表明，丹皮酚对钙粘素的荧光具有显著的猝灭作用，通过猝灭常数随温度变化趋势推断为静态猝灭过程。丹皮酚与钙粘素形成复合物的热力学参数分别为ΔH=

Symbolm@@ 4.3×105 J/mol和ΔS=-1.3×103 J/（mol·K）， 表明此結合过程以氢键和范德华力为主。原子力显微观察结果表明，钙粘素分子间可形成有序长链结构，丹皮酚加入后能显著破坏这种组装结构而形成短链结构，这是由于丹皮酚与钙粘素末端色氨酸残基的作用而影响相邻钙粘素分子结构域间的交错作用所致。本研究结果表明，钙粘素可能是丹皮酚体现其活性的一个重要作用靶点。

关键词丹皮酚； 钙粘素； 荧光光谱法； 原子力显微镜

1引 言

丹皮酚（Paeonol）是在传统中药牡丹皮中提取出的一种小分子酚类化合物。近来的研究发现丹皮酚具有抗肿瘤作用＼[1＼]。药理活性实验显示，丹皮酚对食道癌、胃癌、肝癌、结肠癌等多种癌细胞具有明显的抑制作用＼[2～4＼]。深入探索丹皮酚在体内的各种可能的作用靶点及它们之间的作用机制，可为进一步开发丹皮酚及其衍生物作为抗癌药物提供科学依据。

中药小分子可与人体内的蛋白发生相互作用，从而决定其药理活性作用＼[5＼]。研究发现，丹皮酚和阿魏酸在生理条件下均能与人血清白蛋白（HSA）发生相互作用，并且它们之间会竞争HSA上的同一位点。因此，中医用药常将含有丹皮酚与阿魏酸的中药配伍使用来提高疗效。丹皮酚在体内还可能与其它蛋白产生相互作用，进而影响其药理活性。

钙粘素（Cadherin）是在细胞与细胞粘附过程中发挥重要作用的一类钙离子依赖型粘附蛋白＼[6＼]。Pary ＼[7＼]和AnneKarina ＼[8＼]等的研究都证实了E钙粘素与癌症的发生和发展有重要联系。最近的研究表明，血清中E钙粘素的浓度增高与肿瘤发生及侵袭转移密切相关＼[9～12＼]。胃肠癌患者血清中可溶性钙粘素的浓度显著高于健康对照组，这可能是由于肿瘤细胞表面的E钙粘蛋白降解并释放到血液中的缘故。因而，血清中可溶性钙粘素的浓度可作为预防、诊断和治疗胃肠癌的一个重要指标＼[10，11＼]。

丹皮酚在血液中可与人血清白蛋白发生相互作用。最近的研究证实了丹皮酚可与人血清白蛋白以疏水作用形成复合物＼[13＼]。胃癌患者血清中可溶性钙粘素的浓度平均水平（9344 ng/mL）显著高于健康对照组（5616 ng/mL），并与肿瘤大小呈正相关＼[11＼]。因而，在胃癌患者的血清中，丹皮酚将有更多的机会与钙粘素发生相互作用。本研究采用荧光光谱法和原子力显微技术，分析了丹皮酚与钙粘素的相互作用过程。

2实验部分

2.1仪器与试剂

F7000荧光光谱仪（日本日立公司）； NanoPhotometer N60型超微量分光光度计（德国IMPLEN公司）； PicoplusⅡ型原子力显微镜系统（美国Molecular Imaging公司）。

丹皮酚（纯度≥99%， 上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 钙粘素（ECadherin human， recombinant纯度≥90%）和人血清白蛋白（HSA）， 购自于西格玛奥德里奇（上海）有限公司； 钙粘素原始浓度为0.5 mg/mL。 高定向热解石墨片（HOPG， 爱沙尼亚Mikro Masch公司）。实验用水由MilliQ系统（电阻率>18 MΩ cm）纯化制得。

2.2实验方法

2.2.1荧光光谱测定使用甲醇溶解丹皮酚，配制1 mmol/L溶液，然后用超纯水逐步稀释该溶液， 制得1 μmol/L丹皮酚溶液。用磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.4）稀释钙粘素原始溶液，配制0.2 μmol/L钙粘素溶液，用于光谱测定。在室温和37℃条件下，依次向0.2 μmol/L钙粘素溶液中滴入不同体积1 μmol/L

丹皮酚溶液，混合液在恒温水浴保持5 min后，以280 nm为激发波长，在290～500 nm范围内记录荧光光谱图。

2.2.2原子力显微镜（AFM）观察样品的制备和表征采用磷酸盐缓冲液将不同温度条件下0.2 μmol/L钙粘素与1 μmol/L丹皮酚相互作用的溶液，稀释10倍，用于制作原子力显微镜观察样品。采用磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH=7.4）稀释钙粘素原始溶液，配制0.02 μmol/L溶液，用于观察单独钙粘素结构。制作原子力显微镜观察样品时，分别取50 μL待观察溶液，滴加于新制备的高定向热解石墨片（HOPG）上，静置吸附10 min后，除去液滴，用超纯水冲洗10次以上，用以去除吸附不牢固的蛋白，最后用氩气吹干。在使用原子力显微镜观察前，将样品放在干燥器中保存。

在气相室温条件下，原子力显微镜采用轻敲模式进行成像。成像时使用NSC35探针（Mikromasch），针尖曲率半径<10 nm，力常数7.5 N/m，扫描速度<1 lines/s，成像的共振频率为130 kHz，所得原子力显微图像分辨率均为512 × 512。

3结果与讨论

3.1丹皮酚与钙粘素相互作用的紫外光谱法和荧光光谱法研究

图1A为丹皮酚、钙粘素以及两者相互作用后溶液的紫外光谱吸收图。丹皮酚在275和312 nm处有较强的吸收峰，此结果与文献＼[14＼]一致。钙粘素在280 nm有较强吸收峰。两者相互作用后，溶液的紫外吸收图谱与丹皮酚的图谱极为相似，由于吸收图谱相互叠加，所以吸收强度略有增高。

在紫外吸收测定的基础上，进一步在室温和37 ℃条件下分别测定了丹皮酚对钙粘素荧光光谱的影响。钙粘素在280 nm激发后， 在337 nm处出现最大荧光发射峰见图1B中a曲线，而丹皮酚在此波段没有明显的荧光。逐渐加入丹皮酚， 最大荧光发射峰的强度逐步下降，如图1B中b～k所示。此外，钙粘素最大荧光发射波长从337 nm蓝移至了335 nm。发射波长的蓝移表明钙粘素分子中色氨酸残基的周围环境发生了变化。加入丹皮酚可能使色氨酸残基的吲哚基团重新排列至一个更加疏水的微环境＼[15＼]。荧光猝灭数据可由SternVolmer方程进行分析＼[16＼]：

式中， F0和F分别为无猝灭剂和有猝灭剂时钙粘素的荧光强度， ＼[Q＼]为猝灭剂的浓度， KSV为猝灭常数， Kq是猝灭速率常数。 τ0为没有猝灭剂存在下荧光分子平均寿命， 生物大分子荧光寿命约为10

Symbolm@@ 8 s。

在不同温度条件下计算得到的猝灭常数KSV见表1， KSV随温度升高而降低， 表明丹皮酚对钙粘素的猝灭可能是静态猝灭＼[16＼]。另外，由KSV可粗略推算出Kq值，远大于猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数2.0 ×1010 L/（mol·s）＼[16＼]，进一步表明丹皮酚与钙粘素的作用属于静态猝灭， 它们之间可形成了复合物。

丹皮酚与钙粘素的结合常数（Kb）及结合位点数（n）可由静态猝灭方程进行分析＼[17＼]。

式中， F0和F分别是钙粘素与丹皮酚结合前和结合后的荧光强度。lg（（F0-F）/F）对lg＼[Q＼]作图， 所得直线的斜率为n， 与Y轴截距为lgK。不同温度时所得的K和n值列于表1。由表1可知， K值随温度升高而显著减小， 表明钙粘素与丹皮酚复合物的稳定性逐渐减弱。室温时n≈1，表明丹皮酚在钙粘素上有一个结合位点。

Concentration of paeonol （a-k） is 0， 0.0024， 0.0048， 0.0072， 0.0096， 0.012，0.014， 0.016， 0.019， 0.021 and 0.023 μmol/L， respectively. T=298 K.

在相同條件下，考察了丹皮酚与人血清白蛋白的相互作用。丹皮酚对人血清白蛋白的荧光猝灭图见图1C。通过对猝灭常数的计算推测丹皮酚对人血清白蛋白猝灭也为静态猝灭.计算所得猝灭常数（Ksv）、结合常数（K）及结合位点数（n）数值见表1。结果表明，丹皮酚也可与人血清白蛋白形成复合物。由表1的结合常数值可知，在室温和37℃度条件下，丹皮酚与钙粘素的结合常数值均大于它与人血清白蛋白的值，这表明丹皮酚与钙粘素具有更强的相互作用。

3.2丹皮酚与钙粘素结合反应的热力学函数

当体系中温度变化较小时，结合反应的焓变ΔH可认为是常数。热力学参数焓变ΔH、熵变ΔS及自由能变化ΔG可由Van′t Hoff 方程及自由能公式确定，计算所得ΔH、ΔS和ΔG值列于表 1。

ΔG<0，表明丹皮酚与钙粘素的结合是自发进行的。ΔH<0，表明形成复合物的过程是放热过程。小分子与蛋白相互作用的热力学函数可用于判断它们之间作用力的类型。依据Ross 等关于小分子与蛋白结合过程中热力学数据与各种作用力的关系研究＼[18＼]，ΔH<0和ΔS<0， 表明结合过程以氢键和范德华力为主。

丹皮酚与人血清白蛋白结合的热力学函数也列入了表1中，依据ΔG、ΔH、ΔS值的大小，可推断丹皮酚与人血清白蛋白的结合也是自发进行的。丹皮酚与钙粘素的结合过程中ΔH值远大于它与人血清白蛋白的ΔH，说明丹皮酚与钙粘素能形成更稳定的复合物。Wang＼[13＼]研究表明，丹皮酚与人血清白蛋白主要通过疏水相互作用，形成复合物，导致人血清白蛋白的二级结构和三级结构都发生改变。本研究表明丹皮酚与钙粘素的作用以氢键和范德华力为主。所以，丹皮酚与人血清白蛋白和钙粘素的作用方式不同，使得它与两种蛋白的结合能力有差别。

3.3原子力显微镜（AFM）成像结果分析

运用原子力显微镜可在单分子水平上研究蛋白及其组装结构＼[19，20＼]。图2为钙粘素与丹皮酚作用前后典型的原子力显微镜成像。在图2A中，未与丹皮酚作用的钙粘素呈现为连续长度约500 nm的长链结构及交叉链状结构。与丹皮酚作用后，钙粘素分子间形成的链状结构的长度明显减小（图2B）。此外，作用温度对于钙粘素的结构也有显著影响。 如图2（B～D）所示。随着作用温度逐渐升高，钙粘素分子间形成的长链结构逐步减少。

图2A 中原子力显微镜观察到的长链结构以及交叉链状结构的形成与钙粘素单体的特异结构有关。晶体结构研究结果表明， 钙粘素单体由5个重复的结构域首尾相连而成（EC domain 1～5）＼[21＼]。每个结构域为一个圆筒状结构，其三维尺寸为4.5 nm ×2.5 nm × 2.5 nm。由于每两个结构域连接时存在一个微小的弯曲，致使整个钙粘素单体呈现香肠状，其首尾间的长度约为20.7 nm＼[6＼]。高灵敏力谱实验证实了钙粘素结构域间存在着交错作用，如EC1结构域与另一个分子其它结构域的作用＼[6＼]。这种钙粘素分子结构域间的交错作用可能是形成长达几百纳米长链结构的根本原因。另外，两个钙粘素分子间还能产生EC1结构域间相互作用。每个钙粘素单体的N端（EC1结构域）远侧的色氨酸残基能进入另一个单体的疏水腔，进行链交换作用，形成稳定的二聚体结构＼[21，22＼]。此外，高分辨电镜研究结果表明，钙粘素分子间还能产生更复杂的作用，如3个钙粘素分子间能形成交叉结构，4个分子间能产生四链结构＼[23＼]，这可能是形成图2A中交叉长链状结构的基础。

在图2B中，当钙粘素与丹皮酚作用后，链状结构的长度显著减小，主要是由于丹皮酚与钙粘素分子的N端（EC1结构域）色氨酸残基产生作用，这种作用已被上述荧光猝灭结果所证实，作用后可能影响了钙粘素EC1结构域与其它钙粘素分子结构域间的交错作用，因而不利于形成长链结构。随着作用温度升高至304和310 K，如图2C和2D所示，链状结构进一步减少，可能是因为较高的温度更不利于钙粘素EC1结构域与其它钙粘素分子结构域间的交错作用。

图2D中箭头所示分子的测量平均长度约为50 nm，平均高度为1.8 nm。晶体结构研究结果表明， 钙粘素二聚体长度约为40 nm，直径为2.5 nm＼[6＼]。考虑到原子力显微镜成像蛋白时的针尖加宽效应，此测定值与晶体结构得出的钙粘素二聚体结果较为接近。因此根据原子力显微成像中的形貌结构和几何尺寸判断， 存在钙粘素的二聚体。钙粘素分子间形成二聚体是由于两个钙粘素分子间N端EC1结构域色氨酸残基的链交换作用所致。

本研究中所有原子力显微镜成像都均是在气相条件下获得的。蛋白样品在制样过程中会受到脱水和干燥过程的影响。此外，选用不同的观察基底可能会影响观察结果。分别考察了云母和HOPG为基底成像钙粘素的效果，结果表明，钙粘素在HOPG表面吸附和成像时重现性更好。另外，在HOPG 表面观察到的钙粘素的结构数据与其晶体结构数据也更相符。

4结 论

采用荧光光谱法和原子力显微技术分析了丹皮酚与钙粘素的相互作用。荧光光谱法研究结果表明，丹皮酚对钙粘素的荧光具有显著的猝灭作用，通过猝灭常数的计算及其随温度变化趋势推断这是一个静态猝灭过程。在不同温度条件下，丹皮酚与钙粘素的结合常数均大于其与人血清白蛋白的结合常数值，这表明丹皮酚与钙粘素具有更强的相互作用。丹皮酚与钙粘素作用过程的熵、焓和自由能值表明它们之间的结合是以氢键和范德华力为主的自发进行的过程。高分辨原子力显微观察显示， 与丹皮酚作用后， 钙粘素分子间形成的链状结构的长度明显减小，并随着温度的升高愈加显著。在310 K观察到了钙粘素分子间形成的二聚体结构。本研究结果表明，钙粘素可能是丹皮酚体现其活性的一个重要的作用靶点。

References

1GAO LiMin， MAN QiQian. Drug Evaluation Res.， 2016， 39（2）： 300-303

高立民，满其倩. 药物评价研究， 2016， 39（2）： 300-303

2Xu Y， Zhu J， Lei Z， Wan L， Zhu X， Ye F， Tong Y. J. Physiol. Biochem.， 2016： 1-9

3Yang S， Wang X， Zhong G. Int. J. Clin. Exp. Med.， 2016， 9（7）： 13900-13908

4Wu J， Xue X， Zhang B， Cao H， Kong F， Jiang W， Li J， Sun D， Guo R. Tumor. Biol.， 2016， 37（9）： 12301-12313

5LEI GenHu， LIU LiTing， DAI XiaoJun， WEI YinMao， GONG BoLin. Acta Chimica Sinica， 2010， 68（1）： 55-61

雷根虎， 刘丽亭， 戴小军， 卫引茂， 龚波林. 化学学报， 2010， 68（1）： 55-61

6Pokutta S， Weis W I. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. ， 2007， 23（23）： 237-261

7Guilford P， Hopkins J， Harraway J， McLeod M， McLeod N， Harawira P， Taite H， Scoular R， Miller A， Reeve A E. Nature， 1998， 392（6674）： 402-405

8Perl A， Wilgenbus P， Dahl U， Semb H， Christofori G. Nature， 1998， 392（6672）： 190-193

9Grieve A G， Rabouille C. J. Cell Sci.， 2014， 127（15）： 3331-3346

10Tsalikidis C， Papachristou F， Pitiakoudis M， Asimakopoulos B， Trypsianis G， Bolanaki E， Syrigos K N， Simopoulos C. Folia Medica， 2013， 55（34）： 26-32

11Hu Q P， Kuang J Y， Yang Q K， Bian X W， Yu S C. Int. J. Cancer， 2016， 138（12）： 2804-2812

12Patil P U， D′Ambrosio J， Inge L J， Mason R W， Rajasekaran A K. J. Cell Sci.， 2015， 128（23）： 4366-4379

13Wang J. J. Biochem. Mol. Toxicol.， 2015， 29（5）： 213-220

14Hu S， Liu K， Li Y， Ding Q， Peng W， Chen M. Can. J. Chem. ， 2014， 92（92）： 274-278

15Xiao J， Chen T， Chen L， Cao H， Yang F， Bai Y. J. Inorg. Biochem.， 2010， 104（11）： 1148-1155

16Lakowicz J R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. New York： Springer Science+Business Media， LLC， 2006： 278-327

17TAN Tao， HUANG Rui， XIA ZhiNing. Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（10）： 1415-1420

谭 韬， 黄 锐， 夏之宁. 分析化学， 2007， 35（10）： 1415-1420

18Ross P D， Subramanian S. Biochemistry， 1981， 20（11）： 3096-3102

19Peng X， Fu H R， Liu R S， Zhao L， Zu Y G， Xu F J， Liu Z G. Scanning， 2015， 37（2）： 158-164

20SUN Ming， HONG Wei， SHU Jing， LI Li. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（10）： 1471-1476

孙 铭， 洪 玮， 疏 靜， 李 力. 分析化学， 2016， 44（10）：1471-1476

21Boggon T J， Murray J， ChappuisFlament S， Wong E， Gumbiner B M， Shapiro L. Science， 2002， 296（5571）： 1308-1313

22Li Y， Altorelli N L， Bahna F， Honig B， Shapiro L， Palmer A G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2013， 110（41）： 16462-16467

23He W， Cowin P， Stokes D L. Science， 2003， 302（5642）： 109-113