连芩解毒颗粒提取工艺研究

邓桂明，何 海，葛金文*，肖小芹，陈 镇，张志国，吴 萍，戴 冰，欧阳林旗，肖望重，向 彪

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208）

连芩解毒颗粒提取工艺研究

邓桂明1,2，何 海1，葛金文2*，肖小芹2，陈 镇1，张志国1，吴 萍1，戴 冰1，欧阳林旗1，肖望重1，向 彪1

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208）

目的优选连芩解毒颗粒的最佳提取工艺。方法以盐酸小檗碱及黄芩苷的转移率为考察指标，结合单因素及正交试验法，对连芩解毒颗粒的提取工艺进行优化。结果优选出连芩解毒颗粒的最佳提取工艺为：药材用60%乙醇浸泡1.0 h，回流提取 2 次，第一次 1.5 h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1 h，料液比 1∶8（g∶mL）。结论优选的提取工艺稳定、可行，为连芩解毒颗粒的生产制备提供实验依据。

连芩解毒颗粒；正交试验；提取工艺；盐酸小檗碱；黄芩苷

连芩解毒颗粒原方为湖南中医药大学第一附属医院耳鼻喉科协定制剂处方。由黄连、黄芩、黄芪等组成，具有清热解毒，扶正培本之功效，用于鼻炎、咽炎、鼻咽癌及EB病毒阳性的鼻咽癌高危人群的抗病毒治疗。本实验根据方中各药味的化学成分及药理作用，以盐酸小檗碱及黄芩苷的转移率为考察指标，结合单因素及正交试验法，优选最佳的提取工艺，为连芩解毒颗粒的研发提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

盐酸小檗碱、黄芩苷对照品 (批号分别为110713-201009、100715-201002，供含量测定用，中国药品生物制品检定所)，制备连芩解毒颗粒所用药材经湖南中医药大学第一附属医院张志国教授鉴定为正品，水为蒸馏水，流动相用色谱纯试剂，其余所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Agilent1100系列高效液相色谱仪 (DAD检测器，Agilent1100 工作站)；Adventurer TM SOPYJ-020万分之一电子分析天平 (奥豪斯国际贸易上海有限公司)；KQ-600型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；LH-1型电热恒温真空干燥箱 （上海医疗器械七厂）；SHB-III型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

2 方法与结果

图1 连芩解毒颗粒HPLC图

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液的制备[1]取已定容连芩解毒颗粒处方的醇提液，摇匀，精密量取25 mL，置蒸发皿中蒸干，放冷，加60%的乙醇50 mL，溶解，摇匀，滤过，精密量取2 mL续滤液，置5 mL量瓶中，加60%的乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 混合对照品溶液的制备[1]分别精密称取减压干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品、黄芩苷对照品适量，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，得质量浓度分别为0.09 mg/mL、0.048 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2 色谱条件

2.2.1 分析条件 色谱柱：KromasilC18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（48∶52）； 检测波长分别为 280 nm，345 nm； 流速1 mL/min；柱温 30℃。

2.2.2 系统适用性试验 将空白溶液、混合对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液依次进样10 μL，见图1，结果表明空白溶液及阴性供试品溶液无干扰，混合对照品溶液及供试品溶液中各组分峰分离完全；理论塔板数按盐酸小檗碱和黄芩苷计均在4 000以上。

2.3 方法学观察

2.3.1 线性范围 分别精密吸取上述混合对照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10 μL，注入色谱仪，记录色谱峰图，以峰面积为y轴，进样量为x轴作回归方程，得盐酸小檗碱回归方程为：Y=665.16X+8.026 5，r=0.999 9，黄芩苷回归方程为：Y=1 014.0X-10.911，r=0.999 3；结果表明：盐酸小檗碱、黄芩苷进样量分别在 0.018～0.18 μg、0.0096 μg～0.096 μg时，峰面积和进样量呈现良好的线性关系。

2.3.2 精密性试验 精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，按照“2.2”项下色谱条件，重复进样 6 次，记录峰面积，盐酸小檗碱、黄芩苷峰面积的RSD分别为2.02%、1.76%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 分别于 0、2、4、6、8、24 h 精密吸取同一供试品溶液10 μL，注入色谱仪，记录峰面积。盐酸小檗碱、黄芩苷峰面积RSD分别为2.07%、2.63%。表明样品在24 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批次药材，精密称定，平分6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件测得盐酸小檗碱、黄芩苷含量的RSD分别为1.39%、1.86%，表明方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密量取6份各供试液1.0 mL，精密加入混合对照品溶液1.0 mL，摇匀，吸取10 μL注入色谱仪。计算盐酸小檗碱、黄芩苷平均回收率为102.37%、96.72%,RSD为1.01%、1.04%。

2.4 实验结果

2.4.1 提取方法的观察 按处方量称取五味药材粗粉（90 g），用60%乙醇浸泡1.0 h后超声提取两次，第一次 1.5h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1.0 h，料液比 1∶8（g∶mL）。 同理，选择 60%乙醇为提取溶媒，回流提取 2 次，第一次 1.5h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1.0 h，料液比 1∶8（g∶mL），按“2.1”项下方法制备供试品溶液并测定盐酸小檗碱、黄芩苷的转移率，比较回流法和超声法的提取效果，见表1。

表1 提取方法考察

结果表明：回流法提取的盐酸小檗碱、黄芩苷的转移率比超声法提取的均要高，提取方法以回流法较佳。

2.4.2 提取溶剂的考察 取药材粗粉81 g，分别以蒸馏水，60%乙醇，按 “2.4.1”所述回流提取方法提取2次，分别测定盐酸小檗碱、黄芩苷的转移率，见表2。

表2 提取溶剂考察

结果表明：60%乙醇提取盐酸小檗碱、黄芩苷的转移率比蒸馏水提取均要高，且水提后得到的溶液黏度较大，含有较多的水溶性杂质，对后续的过滤和浓缩会产生一定的影响，故选择乙醇为提取溶剂。2.4.3 提取次数的观察 在上述正交试验优选的工艺条件基础上，增加一次提取，考察提取次数对浸出效果的影响，按处方量称取五味药材粗粉（90 g），第一次 1.5 h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1 h，料液比1∶8（g∶mL），第三次 1h，料液比 1∶8（g∶mL），分别收集三次提取液，分别测定盐酸小檗碱、黄芩苷的转移率，结果见表3。

表3 提取次数考察

结果表明：第三次提取得到盐酸小檗碱、黄芩苷的转移率均小于三次提取总量的10%，故选择提取两次合理。

2.4.4 浸泡时间的观察 取药材粗粉81g，60%乙醇分别浸泡 0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h 后，按“2.4.1”所述回流提取方法提取2次，分别测定盐酸小檗碱、黄芩苷的转移率，结果见表4。

表4 浸泡时间考察

结果表明：延长浸泡时间对盐酸小檗碱、黄芩苷的转移率的影响变化不大，结合生产，选择浸泡时间为1.0小时。

2.4.5 乙醇回流提取正交试验考察 根据单因素考察结果，为进一步优化提取工艺，选择乙醇浓度、乙醇用量、提取时间作为观察因素，以盐酸小檗碱、黄芩苷转移率为评价指标，进行综合评分[2]，用L9（34）正交表安排试验。工艺因素水平见表5，正交设计与实验结果见表6，方差分析见表7。

表5 提取工艺因素水平表

表6 正交设计与实验结果

表7 方差分析表

正交设计与实验结果表明，直观分析极差可知，影响提取效果的因素顺序为A＞B＞C，方差分析表表明，A、B 因素差异有统计学意义（P＜0.05），且 A、B 因素各水平间差异也有统计学意义（P＜0.05），而C因素差异无统计学意义 （P＞0.05），C 因素各水平间差异也统计学意义（P>0.05），出于节省时间考虑，最终确定该复方的最佳提取工艺为A2B2C1，即最佳提取工艺条件为：五味药材用60%的乙醇水溶液浸泡1.0 h，回流提取2次，第一次 1.5 h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1 h，料液比1∶8（g∶mL）。

2.5 提取工艺的验证实验考察

根据提取工艺单因素实验与正交试验优选的最佳提取工艺条件，拟定工艺验证实验，平行提取三份，分别测定盐酸小檗碱、黄芩苷的转移率为80.64%和77.47%，结果表明：该结果方法可取。

3 讨论

中药成分复杂、药效各异，组成复方并非药物简单相加，因此对复方中药一般采取复方提取[3-4]。本实验在提取工艺设计前根据处方的功能、主治，通过文献资料的查阅，分析每味中药的有效成分与药理作用；结合提取原理与预试验结果，以君药黄连中盐酸小檗碱及臣药黄芩中黄芩苷的转移率为考察指标，通过单因素考察及正交试验，优选最佳的提取工艺[5-6]。结果表明该法简单、稳定、可靠，可作为连芩解毒颗粒提取工艺。

本试验结合单因素及正交试验法，对连芩解毒颗粒的提取工艺进行优化筛选，确认连芩解毒颗粒的最佳提取工艺条件为：60%乙醇浸泡1.0 h，回流提取 2 次，第一次 1.5 h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次1 h，料液比 1∶8（g∶mL）。 该工艺稳定，可行，为该制剂的研制提供了科学的实验依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010.285.

[2]任爱农,高 燃,田耀洲.多指标综合评分法优选清清颗粒提取工艺[J].中成药,2008,30（7）:1059-1062.

[3]于秀娟.扶正颗粒剂提取工艺的优化 [J].医学信息,2012,25(12):165-166.

[4]张 霞,王 荣,杨建宏,等.正交试验法优选复方芸归颗粒提取工艺[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(18):45-47.

[5]常占瑛,刘桂花,高晓黎,等.复方必清片的提取工艺优选[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(22):51-55.

[6]曾 明,吴国海,边佳明，等.舒通无糖颗粒制备工艺研究[J].中国医药导报,2012,9(24):121-123.

（本文编辑 李 杰）

Study on the Extraction Process of Lianqin Jiedu Granule

DENG Guiming1,2,HE Hai1,GE Jinwen2*,XIAO Xiaoqin2,CHEN Zhen1,ZHANG Zhiguo1,WU Ping1,DAI Bing1,OUYANG Linqi1,XIAO Wangzhong1,XIANG Biao1
(1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;2.The College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo optimize the extraction technology of Lianqin Jiedu granules.MethodsThe transfer rate of berberine hydrochloride and baicalin rate as indexes,combined with single factor and orthogonal test method,the extraction process of Qinlian Jiedu granule was optimized.ResultsThe optimal extraction process was 60%ethanol immersion 1.0 h,reflux extraction 2 times,the first time 1.5 h,1∶10 (g∶mL),second time 1 h,1∶8 (g∶mL).ConclusionThe optimized extraction technology is stable and feasible,provide experimental basis for industrial production of Lianqin Jiedu granules.

Lianqin Jiedu granule;orthogonal test;extraction process;berberine;baicalin

R283.6

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.02.011

2015-11-30

湖南省科技厅博士后基金项目（2014RS4013）；2014年湖南省人力资源和社会保障厅博士后研究人员日常经费资助项目；张志国全国名老中医药专家传承工作室建设项目(国中医药人教教育〔2016〕。

邓桂明，女，在站博士后，副主任药师，硕士研究生导师，研究方向：药物新剂型与新技术研究。

*葛金文,男，博士，教授，博士研究生导师，E-mail:40831556@qq.com。

本文引用：邓桂明，何 海，葛金文，肖小芹，陈 镇，张志国，吴 萍，戴 冰，欧阳林旗，肖望重，向 彪.连芩解毒颗粒提取工艺研究[J].湖南中医药大学学报，2017，37（2）：157-159.