低氧胁迫对河川沙塘鳢抗氧化酶及ATP酶活性的影响

贾秀琪，张宏叶，王 丽，于兴达，王佩佩，张国松，尹绍武

（南京师范大学生命科学学院，江苏省生物多样性与生物技术重点实验室，南京 210023）

低氧胁迫对河川沙塘鳢抗氧化酶及ATP
酶活性的影响

贾秀琪，张宏叶，王 丽，于兴达，王佩佩，张国松，尹绍武

（南京师范大学生命科学学院，江苏省生物多样性与生物技术重点实验室，南京 210023）

研究了在急性低氧1.5 h、5 h和慢性低氧3 d下，河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）5种组织（心、脑、肝、鳃和肾）的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）3种抗氧化酶和ATP酶活性的变化规律。结果显示：在急性低氧暴露1.5 h时，河川沙塘鳢SOD和GPX的活力在各组织中与对照组相比均无显著差异，CAT活力在心、鳃和肝3种组织呈现显著升高（P＜0.05），ATP酶活力在心和肝组织极显著升高（P＜0.01）；在急性低氧暴露5 h时，除肝组织SOD酶活性显著降低外（P＜0.05），其它4种组织的CAT、GPX和ATP酶均不同程度显著升高（P＜0.05）；在慢性低氧处理3 d时，心、脑组织的抗氧化酶已基本恢复至与对照组无显著差异的水平，但鳃、肝和肾中酶活力仍较高（P＜0.05）。研究表明，河川沙塘鳢能通过自身调节抗氧化酶及ATP酶活性，改变代谢底物，提高机体适应低氧环境的能力。

河川沙塘鳢；低氧胁迫；SOD；CAT；GPX；ATP酶

溶解氧是水生生物生存的一个重要环境因子，但是在淡水水体中氧浓度存在日常和季节性的波动，水体中溶解氧含量的变动直接影响着鱼类的生命活动。尽管氧气是生命体的必须物质，但在有氧呼吸过程中线粒体呼吸链中“电子逃逸”会造成活性氧（ROS）的产生［1］。在正常生理条件下，有机体内的ROS处于一种不断地产生、又不断地被抗氧化系统清除的动态平衡状态。低浓度、稳定平衡的ROS含量对有机体具有积极作用［2-3］。而当有机体受到低氧胁迫时，体内ROS的产生和消除失衡，如RATHORE等［4］和DESIREDDI等［5］研究发现缺氧导致ROS含量增加，过多的ROS就会对机体产生毒害—破坏生物大分子，影响细胞活性［3，6］。机体的抗氧化酶系统作为活性氧的清除系统，在参与活性氧的清除以及机体的保护性防御反应中发挥巨大作用。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是动物体内抗氧化酶系统的重要组分。机体通过调节这些抗氧化酶的活性来抵御缺氧造成的氧化压力［7］。同时，缺氧会导致有氧代谢降低和无氧代谢增加，随之能量代谢系统也会受到影响［8-9］，ATP酶是参与能量代谢关键酶，因此ATP酶也会受到水体溶解氧的影响。近年来，缺氧对水生动物影响的研究主要集中在摄食、生长、呼吸和代谢等方面。如低溶氧量下，舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）的摄食量减少、生长减慢［10］，黄尾平口石首鱼（Leiostomus xanthurus）鳃组织中超氧化物岐化酶和乳酸脱氢酶的活力上升［11］。

河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）属鲈形目（Perciformes）沙塘鳢科（Odontobutidae）沙塘鳢属，俗称：浦鱼、土布鱼、虎头鲨、虎头呆子。在我国广泛分布于长江中下游、钱塘江、闽江等水系［12］，属于中国特有种。该鱼为淡水底栖小型肉食性鱼类，肉质细嫩，系餐桌名肴，已成为一个具有潜力的水产养殖新品种。国内外关于河川沙塘鳢的报道多集中于生物学、养殖、营养代谢、遗传育种等方面的研究［13-20］，对于该鱼应对低氧胁迫的研究还未见报道。因此，本文研究了低氧胁迫下河川沙塘鳢体内3种抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和ATP酶活性的变化情况，以期为进一步阐述河川沙塘鳢的低氧适应机制提供一定的参考资料，为该鱼抗逆新品种的选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验时间、地点和材料

实验于2015年7～8月在南京师范大学进行，实验用的河川沙塘鳢取自南京市水产科学研究所禄口基地，规格为体质量40～50 g的健康成鱼。将其分养在水族箱（80 L）内，同时放入一定量体长为4～5 cm的鲮鱼（Cirrhinus molitorella）与日本沼虾（Marcrobrachium nipponense）作为饵料，每天16∶00进行抽污。水族箱内维持溶氧（6.8±0.2）mg·L-1，水温（25±1）℃。驯养7 d后进行实验。

1.2 实验设计

1.3 样品制备

实验处理后，每组随机取3 ind河川沙塘鳢纱布擦干解剖。取河川沙塘鳢的心、脑、肝、肾、鳃组织，3 ind实验鱼同一组织放在同一试管中混样，制备成10%组织匀浆，然后将匀浆液离心（转速12 000 r·min-1，时间10 min，温度4℃）后取上清液加入0.85%的生理盐水配备1%的组织匀浆样品，用于各指标的测定。

1.4 酶活力测定方法

采用南京建成生物公司的检测试剂盒测定组织中抗氧化酶SOD、CAT、GPX及ATP酶的活力。按照试剂盒中的说明，SOD活力的测定采用黄嘌呤氧化酶法，CAT活力采用钼酸铵显色法，GPX活力采用DTNB显色法，ATP活力采用定磷法，相应操作步骤参照试剂盒说明书。

1.5 数据分析

数据采用SPSS 17.0统计软件的单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法分析比较不同时间段试验组与对照组的活力差异：P＜0.05时，为显著差异；P＜0.01时，为极显著差异。

2 结果与分析

2.1 低氧胁迫对河川沙塘鳢不同组织SOD活性的影响

两组睡前均给予服用硝苯地平（福建中合医药股份有限公司生产，国药准字H35020579），起始剂量为10 mg，2次/d，根据病情可酌情增加，最大剂量≤40 mg，3次/d。对照组在此基础上口服氟伐他汀（海正辉瑞制药有限公司生产，国药准字H20070168），起始剂量40 mg，1次/d，最大剂量≤80 mg，1次/d。基于此，观察组加用缬沙坦（北京诺华制药有限公司生产，国药准字H20173014），起始剂量80 mg，1次/d，最大剂量≤160 mg，1次/d。

从图1可以看出，在急性低氧暴露1.5 h时，河川沙塘鳢心、脑、鳃、肝、肾各组织中SOD活力与常氧处理的对照组相比均无显著差异；在急性低氧暴露5 h时，河川沙塘鳢心、脑、鳃中SOD活力极显著高于对照组（P＜0.01），肝中SOD活力显著低于对照组（P＜0.05），肾中SOD活力无显著差异；在慢性低氧处理3 d后，脑中SOD活力极显著高于对照组（P＜0.01），肾中SOD活力显著高于对照组（P＜0.05），其它组织均无显著差异。

2.2 低氧胁迫对河川沙塘鳢不同组织CAT活性的影响

由图2可知，在急性低氧暴露1.5 h时，与常氧对照组相比，河川沙塘鳢心和鳃组织的CAT活力显著升高（P＜0.05），肝极显著升高（P＜0.01），脑无明显变化；在急性低氧暴露5 h时，心的CAT活力显著高于对照组（P＜0.05），脑极显著高于对照组（P＜0.01），肝和鳃与对照组相比无显著差异。在慢性低氧处理3 d后；心、脑的CAT活力恢复到与常氧处理组无显著差异，而肝和鳃与对照组相比有极显著差异（P＜0.01），肝中CAT活力高于对照组，鳃中CAT活力低于对照组。在整个低氧处理过程中，肾的CAT活力虽有波动，但与常氧对照组对比，并无显著差异。

图1 河川沙塘鳢5种组织SOD活性随低氧处理时间的变化Fig.1 Changes of SOD activity in five tissue of O.Potamophila

图2 河川沙塘鳢5种组织CAT活性随低氧处理时间的变化Fig.2 Changes of CAT activity in five tissues of O.Potamophila

2.3 低氧胁迫对河川沙塘鳢不同组织GPX活性的影响

由图3可知，在急性低氧暴露1.5 h时，与常氧对照组相比，河川沙塘鳢各组织中GPX的活性均无显著差异；在急性低氧暴露5 h后，脑和肾的GPX活性表现出显著高于常氧对照组（P＜0.05），心极显著高于对照组（P＜0.01），肝和鳃仍无显著差异；在慢性低氧处理3 d后，心、脑的GPX活力恢复到与常氧对照组无显著差异，而肝、鳃和肾极显著高于对照组的GPX活力（P＜0.01）。

图3 河川沙塘鳢5种组织GPX活性随低氧处理时间的变化Fig.3 Changes of GPX activity in five tissues of O.Potamophila

2.4 低氧胁迫对河川沙塘鳢不同组织ATP活性的影响

在急性低氧暴露1.5 h时，河川沙塘鳢心和肝的ATP酶活力极显著高于对照组（P＜0.01），且均达到整个低氧处理的最大值，即心和肝的ATP酶活力最大值分别为（29.58±3.27）U· mg-1和（5.41±0.88）U·mg-1（表1）；而脑、鳃、肾均无显著差异。在急性低氧暴露5 h后，鳃的ATP酶活力极显著高于对照组（P＜0.01），脑和肾显著高于对照组（P＜0.05），心和肝较对照组无显著差异；且脑和鳃的ATP酶活力在这一时段达到最大值。在慢性低氧处理3 d后，心和肾中ATP活力极显著高于对照组（P＜0.01），肝中ATP活力显著高于对照组（P＜0.05），脑和鳃组织的ATP活力恢复到与常氧处理组无显著差异；且肾中ATP酶活力在低氧处理过程中逐渐升高，在这一时段达到最大值（图4）。

表1 河川沙塘鳢5种组织ATP酶相对活性随低氧处理时间的变化Tab.1 Changes of ATP relative activity in five tissues of O.potamophila（U·mg-1）

图4 河川沙塘鳢5种组织ATP酶活性随低氧处理时间的变化Fig.4Changes of ATP activity in five tissues of O.Potamophila

3 讨论

3.1 低氧胁迫对河川沙塘鳢不同组织抗氧化酶活性的影响

提高抗氧化防御与低氧耐受之间的联系最初是由REISCHL提出的。之后的大量相关研究印证了这一联系，研究发现在一些鱼类，如金鱼（Carassius auratus）、鲤（Cyprinus carpio）及葛氏鲈塘鳢（Perccottus glenii），缺氧会引起其体内抗氧化相关酶活性的变化，这表明机体受到了缺氧造成的氧化压力［1，21-22］。缺氧期间ROS的急剧增加，抗氧化防御系统被激活，大多数的抗氧化相关酶（CAT、SOD、GPX、GP、GR、GST、G6PDH）活性会升高［23］，以清除过多的ROS。其中，SOD是已知生物体内唯一以自由基为底物的酶，催化超氧阴离子发生歧化反应转变为H O和O［24］。

222随后由CAT和GPX协同作用，催化H2O2分解为HO和O［25-26］。

22

本研究在急性低氧暴露1.5 h时，河川沙塘鳢各组织中SOD活力和GPX活力与对照组相比，虽然发生波动，但均无显著差异。这与COOPER等［11］报道的降低趋势和LUSHCHAK等［1］报道的升高趋势结果都不一致，可能是由于河川沙塘鳢为底栖鱼类，耐低氧能力强，对于短暂的急性低氧环境可以正常应对，保证机体在胁迫中维持平衡。另外，在这一时段的CAT活力在心、肝及鳃中却表现出显著升高的趋势。从图1可知，心、肝和鳃的SOD活力虽然与对照组无显著差异，但都有所升高。推测低氧胁迫导致产生的SOD活力增加，而催化产生的H2O2主要都由CAT来清除所致［3］。在急性低氧暴露5 h时，随着缺氧时间的延长，河川沙塘鳢体内的3种抗氧化酶大致均表现出上升的趋势，表明鱼体在通过提高抗氧化酶活性抵御缺氧造成的氧化压力［25］。值得一提的是，此阶段肝组织中的3种抗氧化酶却处于下降状态，姜景腾等［27］研究的真鲷（Pagrosomusmajor♀）与黑鲷（Sparusmacrocephalus♂）杂交子一代及LUSHCHAK等［1］研究的葛氏鲈塘鳢（Perccottus glenii）在低氧处理时肝组织也出现了CAT酶活力下降的情况，因此认为此时段低氧使肝中脂类氧化所产生的过多ROS反过来抑制了酶活性。

在慢性低氧处理3 d后，河川沙塘鳢各组织中抗氧化酶活力开始出现下降恢复正常趋势，心、脑组织已基本恢复至与对照组相比无显著差异的水平，但鳃、肝和肾中酶活力仍较高。表明在长时间的缺氧环境下，鱼体通过自身的调节可以维持基本生命活力以适应低氧环境。与其它组织相比，脑和心是维持生命的关键器官。LUSHCHAK等［28］发现鲫（Hypophthalmichthys molitrix）在缺氧时会运送大量的血液到脑，河川沙塘鳢鱼体在应对低氧胁迫时会首先保护关键的器官。另外，据唐功［3］报道，CAT和GPX有浓度互补作用，清除H2O2主要靠CAT，少量由GPX分解。当H2O2浓度高时，CAT催化分解H2O2更有效。H2O2浓度低时，GPX对其分解更有效。当GPX活力降低时，CAT又可代偿增强。因此，在此处理阶段，河川沙塘鳢的肝、鳃和肾3种组织均出现了不同程度的活跃状态。

3.2 低氧胁迫对河川沙塘鳢不同组织ATP酶活性的影响

机体生命活动的正常进行需要能量来维持，ATP是供能的主要物质，ATP的合成受到ATP酶的影响，同时鱼类ATP酶合成及活性均受到水体溶氧变化的影响［8-9］。在急性低氧胁迫1.5 h时，河川沙塘鳢各组织的ATP酶活性均表现出上升趋势，说明河川沙塘鳢对于急性的缺氧环境能通过自身能量系统的调节来提高能量代谢［9，29］。在急性低氧胁迫5 h时，脑、鳃和肾的ATP酶活性继续上升出现小高峰，然而心和肝的ATP酶活性却出现回落。有证据表明，鱼类对低氧适应另一个关键方面就是减少代谢率和代谢需求［30-31］，这可能是引起ATP酶活性回落的原因。在慢性低氧处理3 d后，河川沙塘鳢的脑和鳃表现下降趋势。心和肝又表现上调，肾在整个低氧处理过程都表现出上调趋势。这说明河川沙塘鳢属于耐低氧的鱼类，对于急性和慢性的缺氧环境都能积极应对。有研究显示，鲢（Hypophthalmichthysmolitrix）ATP酶活力对低氧环境表现出先升高后降低的趋势［9］，大鼠心肌对急性低氧环境表现出明显的降低趋势［8］，小鳞毛足鲈（Trichogaster microlepis）ATP酶在低氧环境下有上升的趋势［32］。可见在缺氧应激条件下，不同有机体ATP酶活性均会发生变动，但影响各不相同，表明ATP酶对低氧胁迫比较敏感。

4 小结

河川沙塘鳢体内抗氧化酶和ATP酶对低氧胁迫环境较为敏感，反映了鱼体应对低氧胁迫的抗氧化能力和能量代谢情况。在急性低氧胁迫环境下，鱼体内酶活性起初无明显变化，随缺氧时间的延长，酶活性增强以抵抗胁迫环境。在慢性缺氧环境下，体内酶活性逐渐下降恢复。表明河川沙塘鳢能通过自身调节抗氧化酶及ATP酶活性，改变代谢底物，提高机体适应低氧环境的能力。另外，在应对低氧胁迫环境时，各种酶活性存在组织差异性［28］。与其它组织相比，肝组织CAT酶活性较高，而ATP酶活性却较低。肾组织的SOD、GPX及ATP酶活性在整个低氧处理时段都呈现逐步升高的趋势。

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Effect of hypoxia stress on the antioxidant enzyme and ATP enzyme activity in tissues of Odontobutis potamophila

JIA Xiu-qi，ZHANG Hong-ye，WANG li，YU Xin-da，WANG Pei-pei，ZHANG Guo-song，YIN Shao-wu
（College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Key Laboratory of Biodiversity and Biotechnology of Jiangsu Province，Nanjing 210023，China）

Odontobutis potamophila is a unique small freshwater demersal carnivorous fish in China.As it has a wide development and utilization prospect，a new important artificial breeding commercial fish.Current researches of O.potamophila mainly focus on the biology，breeding，nutrition，metabolism，genetics and breeding at home and abroad.Studies on the hypoxia stress are still relatively rare.Therefore，we analyzed the activity change regularities of three different antioxidant enzymes including superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），glutathione peroxidase（GPX）and ATP enzyme in Odontobutis potamophila after the acute hypoxia for 1.5 h，5 h and chronic hypoxia for 3-day in heart，brain，liver，gills and kidney tissue.Themain results were as follows：

1.During the acute hypoxia exposure for 1.5 h，the activities of SOD and GPX had no significant difference in each tissue compared with the control group.However，the activity of CAT in heart，gills and liver increased significantly（P＜0.05）.The ATP enzyme activity increased extremely significant in heart and liver tissues（P＜0.01）.

2.After the acute hypoxia exposure for 5 h，the SOD activity was significantly lower in liver，the CAT，the GPX and the ATP enzyme increased significantly in different degrees.The activities of SOD increased extremely significant in heart，brain and gill（P＜0.01），butwere significantly lower in liver（P＜0.05）.The activities of CAT increased significantly in heart（P＜0.05）and extremely significant in brain（P＜0.01）.The activities of GPX increased significantly in brain and kidney（P＜0.05）but extremely significant in heart（P＜0.01）.The ATP enzyme increased extremely significant in gill（P＜0.01）and increased significantly in brain and kidney（P＜0.05）.

3.With the chronic hypoxia for3-day，the antioxidantenzymes in brain and heart restored to the level of no significant difference compared with the control group，but the enzyme activity in gill，liver and kidneywas still higher.The activities of SOD increased extremely significant in heart（P＜0.01）and increased significantly in kidney（P＜0.05）.The activities of CAT increased significantly in liver（P＜0.05）but extremely significant in gill（P＜0.01）.The ATP enzyme increased extremely significant in heart and kidney（P＜0.01）and increased significantly in liver（P＜0.05）.

The results suggested that O.potamophila can adjust the antioxidant enzymes and the ATP enzymes activity，change the metabolic substrate，and improve the body＇s ability to adapt to the low-oxygen environmentwith self-regulation.It can be a reference for comprehensive understanding of hypoxia adaptation mechanism in euryhaline fish，also lay the foundation for fish breeding of stress resistant new species.

Odontobutis potamophila；hypoxia stress；superoxide dismutase（SOD）；catalase（CAT）；glutathione peroxidase（GPX）；ATP enzyme

S 965.3

A

1004-2490（2017）03-0306-08

2015-11-25

江苏省科技支撑计划（农业）项目（BE2013441）；“江苏省六大人才高峰”高层次人才项目（2012-NY-032）；南京师范大学科技成果转化基金项目（2013-02）；江苏省普通高校研究生实践创新计划项目（SJLX15_0300）

贾秀琪（1990-），女，硕士研究生，主要从事鱼类种质资源与遗传育种研究。E-mail：1319843137＠qq.com

尹绍武，教授，博士生导师。Tel：025-85891840，E-mail：yinshaowu＠163.com