高效液相色谱法同时测定消炎利胆胶囊中绿原酸和迷迭香酸含量

金贤武，张继红，黄道明

（江西省上饶市食品药品检验所，江西上饶334000）

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高效液相色谱法同时测定消炎利胆胶囊中绿原酸和迷迭香酸含量

金贤武，张继红，黄道明

（江西省上饶市食品药品检验所，江西上饶334000）

目的建立同时测定消炎利胆胶囊中绿原酸和迷迭香酸含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法采用Phenomonex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），以乙腈（A）－0.1%磷酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 m L／min，柱温为30℃，检测波长为330 nm。结果绿原酸、迷迭香酸质量浓度分别在1.37～68.50，0.87～43.60 g／mL范围内与峰面积线性关系良好，加样回收率分别为101.04%和98.78%，RSD分别为2.11%和1.68%(n＝6)。结论该试验所建立的方法准确、可靠、重复性好，可为消炎利胆胶囊的质量控制提供科学依据。

高效液相色谱法；消炎利胆胶囊；绿原酸；迷迭香酸；含量测定；质量控制

消炎利胆胶囊为市售中药复方制剂，属国家中药保护品种。该制剂由穿心莲、溪黄草、苦木3味中药经加工提取制成，具有清热、祛湿、消炎利胆之功效[1]，用于治疗由肝胆湿热引起的口苦、胁痛、急性胆囊炎、胆管炎，疗效较好[2]。据报道，穿心莲中含有绿原酸等酚酸类成分[3]，溪黄草中含有咖啡酸、迷迭香酸等酚酸类成分[4]，苦木中含有生物碱类成分[5]。药理活性研究表明，绿原酸具有广泛的抗菌、消炎、止血作用，可显著刺激胆汁的分泌，具有利胆之功效[6]；迷迭香酸具有抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节等生物活性[7]，常作为中药及制剂质量控制的指标成分[8－11]。目前，消炎利胆胶囊的质量控制方法为国家食品药品监督管理局标准WS3－135（Z－135）－2002Z－2011[12]。标准中采用薄层色谱（TLC）法对制剂中穿心莲、溪黄草、苦木药材进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法对方中穿心莲的主要成分——穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量进行测定[13]。由于中药复方所含化学成分多样复杂，各成分之间具有协同作用，仅以一种或单类有效成分无法全面表征中药制剂的物质基础，难以全面控制其内在质量[14]。故本试验中以穿心莲中的绿原酸和溪黄草中的迷迭香酸为指标性成分，建立其HPLC含量测定方法，为消炎利胆胶囊制剂的质量控制和评价提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695型高效液相色谱仪，包括Waterse2489检测器，Empower工作站（美国Waters公司）；CPA225D型电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ－500DE型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；纯水仪（易普易达科技有限公司）。

1.2 试药

绿原酸对照品（批号为110831～201204）、迷迭香酸对照品（批号为111871～201404）均购自中国食品药品检定研究院，纯度均不小于98%；消炎利胆胶囊（哈尔滨一洲制药有限公司，批号为150904，141205，150609，141007、131003，141004）；甲醇(Merck公司)为色谱纯；磷酸、分析甲醇为北京化工产品；水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomonex®C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸溶液；流速：1.0 m L／min；柱温：30℃；检测波长：330 nm；进样量：10μL。流动相采用如下梯度洗脱程序：0～26 min，6%～22%A；26～58 min，22%～26%A。

2.2 溶液制备

对照品溶液：称取绿原酸、迷迭香酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为68.5，43.6μg／mL的混合对照品溶液，摇匀，即得。

供试品溶液：取消炎利胆胶囊10粒，混匀，研细，取约1.0 g，精密称定，置100 m L容量瓶中，加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理30min，冷却，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，即得。

阴性对照品溶液：依据处方制备缺穿心莲、溪黄草的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10μL，注入HPLC仪，按2.1项下色谱条件分析，结果见图1。结果表明，2种被测成分能完全分离，阴性对照无干扰。

1.绿原酸2.迷迭香酸A.对照品溶液B.供试品溶液C.阴性对照品溶液图1高效液相色谱图

线性关系考察：分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0mL，置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。分别精密吸取10μL注入HPLC仪分析，以峰面积(Y)对质量浓度(X)进行线性回归。结果绿原酸进样质量浓度在1.37～68.50μg／m L范围内与峰面积线性关系良好，回归方程为Y＝33 270X－3 394，r＝0.999 9(n＝6)；迷迭香酸进样质量浓度在0.872～43.60μg／mL范围内与峰面积线性关系良好，回归方程为Y＝32 918X＋5 116，r＝0.999 8 (n＝6)。

精密度试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积并计算RSD。结果绿原酸、迷迭香酸的RSD分别为0.82%和1.66%(n＝6)，表明仪器精密度良好。详见表1。

稳定性试验：取同一批供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别于0，2，4，6，8，12，24 h时进样分析，记录峰面积并计算RSD。结果，绿原酸、迷迭香酸的RSD分别为1.03%和1.24%(n＝7)，表明供试品溶液在24 h内稳定。详见表2。

重复性试验：取同一批样品，按2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件分析，记录峰面积并计算RSD。结果绿原酸、迷迭香酸的RSD分别为1.18%和1.98%(n＝6)，表明方法重复性良好。详见表3。

加样回收试验：取已知含量的样品6份，每份约0.5 g，按1∶1的比例加入对照品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分析，计算回收率。结果见表4。

2.4 样品含量测定

取不同批次样品约1.0 g，每个批次平行取3份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分析，以外标法计算含量。结果见表5。

表1 精密度试验结果（n＝6）

表2 稳定性试验结果(n＝7)

表3 重复性试验结果（n＝6）

表4 加样回收试验结果(n＝6)

表5 样品含量测定结果（， g／g，n＝3）

表5 样品含量测定结果（， g／g，n＝3）

含量（mg／g）迷迭香酸0.3891±0.007 0.3369±0.008 0.2012±0.005 0.3245±0.004 0.4556±0.005 0.2274±0.006批号150904 141205 150609 141007 131003 141004绿原酸1.2087±0.023 1.5364±0.031 0.7894±0.018 0.9645±0.024 1.1439±0.032 0.5347±0.011

3 讨论

3.1 指标性成分选择

绿原酸为穿心莲药材中的有效成分，具有广泛的抗菌、消炎作用，可显著刺激胆汁分泌，具有利胆之功效。迷迭香酸为溪黄草药材中的主要有效成分，药理活性研究表明其具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节等活性。2种成分是消炎利胆胶囊发挥消炎利胆功效的主要活性成分，含量的高低会影响临床疗效，故选择绿原酸和迷迭香酸作为指标性成分，能有效反映消炎利胆胶囊的质量，为消炎利胆胶囊制剂的质量控制提供科学依据。

3.2 检测波长选择

全波长扫描结果显示，绿原酸最大吸收波长为327 nm，迷迭香酸最大吸收波长为330 nm。本研究中，在采用330 nm作为检测波长时，绿原酸和迷迭香酸能同时成为主要吸收峰，分离度较好，峰形良好，且其他物质对绿原酸和迷迭香酸的测定无干扰，能达到测定要求，故选择330 nm作为检测波长。

3.3 流动相选择

绿原酸和迷迭香酸均为弱酸性成分，在流动相中加入一定的酸能抑制其电离，改善峰型。参照文献[15－16]，本试验中考察了甲醇－酸水，乙腈－酸水2种流动相。结果表明，乙腈较甲醇更能使被测成分达到完全分离，且柱压小、基线平，各色谱峰的分离度和理论板数均能达到要求，故最终选择乙腈－0.1%磷酸为流动相。

3.4 提取条件选择

本试验中先对甲醇和乙醇2种提取溶剂进行考察，结果显示甲醇的提取效率高于乙醇。鉴于绿原酸和迷迭香酸中均含有羟基等亲水性取代基，具有一定的水溶性，故本试验中考察了50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇3种不同浓度的甲醇溶剂。结果显示，当甲醇溶液体积分数为70%时，2种被测成分提取率最高；同时本试验中还对提取方法（超声、回流）、提取时间（30，45，60min）、料液比（1∶25，1∶50）进行了考察。最终选择以50倍量70%甲醇超声提取30min，被测成分提取完全，且耗时少。

3.5 方法评价

HPLC法同时测定消炎利胆胶囊中绿原酸和迷迭香酸的含量，方法稳定可行，灵敏度高，重复性好，分离效果强，其他组分干扰小，回收率高，且操作简便、快速，可为消炎利胆胶囊的质量评价和质量标准的提高提供理论依据。含量测定结果表明，不同批次的消炎利胆胶囊中绿原酸和迷迭香酸的含量存在显著差异，进一步说明仅以穿心莲内酯类成分进行质量控制并不能完全保证消炎利胆胶囊制剂的质量。

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Content Determ ination of Chlorogenic Acid and Rosm arinic Acid in Xiaoyan lidan Capsules by HPLC

Jin Xianwu，Zhang Jihong，Huang Daoming
（Shangrao Food and Drug Inspection，Shangrao，Jiangxi，China 334000）

Objective To establish an HPLC method for content determination of chlorogenic acid and rosmarinic acid in Xiaoyanlidan Capsules.M ethod The phenomonex®－C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）was adopted，the mobile phase was composed of acetonitrile（A）－0.1%phosphoric acid（B）solution with gradient elution，the flow rate was 1.0 m L／min，the column temperature was 30℃，the detecting wavelength was set at 330 nm.Results The ranges of calibration curve of chlorogenic acid and rosmarinic acid were 1.37－68.50，0.87－43.60μg／mL，with the average recoveries of 101.04%and 98.78%，RSDs were 2.11%and 1.68%，respectively（n＝6）.Conciusion The method is accurate，reliable and repeatable，which can provide a more comprehensive basis for quality control of Xiaoyanlidan Capsules.

HPLC；Xiaoyanlidan Capsules；chlorogenic acid；rosmarinic acid；content determination；quality control

R927.2；R975＋.5

A

1006－4931(2017)10－0031－04

2017－02－15)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.008

江西省上饶市科技局支撑项目[20162CZD12]。

金贤武，男，大学本科，主管药师，研究方向为药物质量分析，（电子信箱）jinxianwu2016＠163.com。

黄道明，男，大学本科，副教授，研究方向为药物质量分析，（电子信箱）737259639＠qq.com。