大鼠骨缺损愈合里骨痂的形成过程中H19的表达情况

苏 杭姚军威

(武汉体育学院研究生院,湖北武汉430079)

大鼠骨缺损愈合里骨痂的形成过程中H19的表达情况

苏 杭姚军威

(武汉体育学院研究生院,湖北武汉430079)

研究目的:通过检测H19在骨损伤之后愈合过程中的表达变化探讨骨损失愈合的相关细胞和H19的关系。研究方法:大鼠左后肢股骨做骨缺损造模,右后肢股骨做假手术处理。于5d、10d、15d、20d、25d断颈法处死。实时荧光定量PCR测定H19表达。研究结果:在5d到25d中,H19在损伤组和对照组均有表达;损伤后5d,实验组H19的表达量是对照组的两倍;损伤后10d,实验组H19的表达量是对照组的两倍;损伤后15d、20d、25d,实验组H19的表达量和对照组H19的表达量基本持平。研究结论:H19促进骨细胞的增殖与分化,可加速骨损伤的愈合。

骨损伤愈合;印记基因;H19

胚胎发育8周左右，围绕脊髓的部分开始通过胚胎结缔组织的间叶分化，形成膜化骨。大多数膜化骨之后被软骨化骨所替换，软骨成骨进一步发展为骨，一小部分骨是直接从膜化骨衍生而来的。结缔组织膜衍生骨，称为骨化始于胚胎，直到骨骼发育完成。原骨是由膜骨化而来的，次骨是由软骨骨化而来的。

重新构建骨的连续性即称作骨愈合，属于平衡机制的细胞修复过程，伴随多个因子参与，多个因素影响，其生物学过程复杂而多变。细胞的增殖、分化、募集、迁移，都参与骨的重塑。各种细胞生长因子的旁分泌和自分泌，骨损伤愈合过程中骨修复细胞的分化和增殖，对骨形成的调节有着十分重要的作用。

印记基因是指同源基因只表达亲本来源其中的一个，而从另一方不表达。精卵结合，基因遗传给后代时，父系和母系等位基因发生改变，进而表达特点发生改变，于是印记发生。同链顺式作用位点称为印记中心，该中心成簇存在80%的印记基因。异常的印记基因表达会导致多种缺陷类疾病。有研究发现，在胎儿的生长发育中，印记基因是作为重要的调节器发生作用的。

损伤后的骨再生，是局部骨的再发育的过程，目前骨修复和印记基因之间的关系报道基本属于空白。创伤中常常存在一些常见的疾病，如骨质疏松、骨折、骨缺损、骨折延迟愈合、骨折不愈合和愈合缓慢，所以促进新骨生长在治疗中是极为重要的。在这项研究中，检测印记基因H19在骨损伤修复部位的表达，探索印记基因与骨损伤修复的关系，为临床上治疗骨伤，促进骨骼生长发育等提供一些必要的理论基础。

1 实验方法

1.1 实验动物分组

实验组：左后肢做骨缺损造模，麻醉处理，左后肢剪毛，沿股骨长轴方向做3cm开口，拨开肌肉，于股骨中段骨皮质上做切口，切至髓腔即刻停止，青霉素消毒缝合。

对照组：右后肢做假手术处理。

1.2 实验动物取材

分别于伤后5d、10d、15d、20d、25d采用断颈法处死，取适量左右后侧股骨组织。分组标记并处理：-80℃下保存，多聚甲醛固定。

1.3 RT-PCR法

1.3.1 总RNA提取

（1）标本于-80℃或液氮中保存，用已经消毒的工具于冰上取约100mg组织，Trizol研磨，倒入1.5ml EP管中，加入三氯甲烷250µl，混匀，冰上静置。

（2）混合液，4℃ 10000g，10min离心。超净工作台操作，取上清500µl，加入等体积3℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置15min。

（3）溶液4℃，10000g，10min离心，小心倒掉液体，加入1mL 4℃预冷的75%乙醇，清洗RNA沉淀。4℃，10000g，5min离心，倒掉液体，干燥数分钟，乙醇充分挥发，加入20µl RNase-Free Water，溶解RNA。

1.3.2 第一链cDNA合成

第一链cDNA的合成采用First Strand cDNA Synthesis Kit进行

（1）取11µlRNA溶液，加入1µl oligo（dT）18，于PCR仪上65℃保温5min，迅速置冰上冷却2min。

（2）依次加入4µL 5×buffer，2µl 10mM dNTPs，1µlRNA inhibitor和1µl反转录酶，用PCR仪处理。

1.3.3 荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是在Life technologies公司的StepOneTMReal-Time PCR上完成，每个样品均作3个复孔，使用SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒进行：

反应程序为：

预变性 95℃，1min

循环（40次） 95℃，15s→58℃，20s→72℃，20s

末段延伸 72℃，5min

溶解曲线 72℃→95℃，每20s升温1℃

反应体系为：

2× qPCR Mix 5.0µL

引物工作液（2.5µM） 1.0µL

Template 1.0µL

ddH2O 2.8µL

Rox 0.2µL

Total 10µL

2 实验结果

2.1 实时荧光定量PCR

从曲线图看出：GAPDH、U6、H19溶解曲线没有杂峰，峰形窄、尖，表明扩增产物特异性良好；H19扩增曲线光滑呈S型，指数扩增期、平台期明显，表明扩增结果理想。

2.2 不同时期实验组和对照组H19 CT值情况

如图1，在骨损伤愈合过程中，5d和10d损伤组H19比对照组明显升高，非常具有显著性差异（P＜0.01）。15d、20d、25d实验组和对照组的H19表达基本无变化，没有显著性差异（P＞0.05）。随着愈合进程的推移，表达量逐渐下降。

3 分析讨论

3.1 骨损伤愈合过程

图1

骨损伤后的修复是一个特殊的过程，不同于结缔组织的纤维状瘢痕，细胞和分子事件有序发生产生新骨。产生新骨的一系列有序过程受到系统和局部因子的调控，早期组织学理论认为，人体骨折愈合的一般模式是以软骨内成骨为基础，按时间顺序分为血肿、炎症、血管再生、软骨发生到骨发生最后是骨的重构。很少见到基于没有骨膜反应和可见骨痂形成的膜化骨的直接愈合。膜化骨和软骨化骨的特点是由不同的细胞迁移分化，细胞外基质对钙的形成和组织，以及局部和系统调控的不同所决定的。除了骨折愈合的经典组织学进程，对于这些进程的调控机制在细胞和分子水平还存在许多未解的问题。

胚胎发育过程中的骨形成是由骨髓间充质干细胞（MSC）的聚集和凝聚，随后通过软骨发育进而软骨内骨化，或通过成骨细胞分化进而膜内骨化。虽然在成人骨里骨髓间充质干细胞极其稀少，骨膜里的骨祖细胞和骨髓里未分化的多能间充质干细胞，参与愈合组织的形成，这对骨折的愈合构建非常重要。

骨损伤后，骨损伤区域有血肿发生，炎性细胞浸润。骨损伤后5d，血肿基本完全清除，原始骨痂由骨膜反应形成，骨损伤处充质细胞集结，骨膜下骨祖细胞增殖。骨折后10d骨损伤处肉芽组织生长，骨膜反应持续增长，骨膜下骨祖细胞向成骨细胞分化，软骨细胞形成。骨折后15d，新生骨小梁在骨膜下形成。骨折后20d，膜内成骨区骨小梁开始相互连接，成骨细胞向骨细胞转化，成骨细胞零星分布于软骨骨痂中和纤维骨痂中。骨折后25d，膜内成骨区骨小梁融合成片，新的骨小梁渐渐取代软骨骨痂。

3.2 H19与细胞分化

在最近的发现中，印记基因在细胞分化方面具有至关重要的作用，包括在胚胎干细胞（ESCs），诱导性多功能干细胞（iPSCs）和成人干细胞。在雄性和雌性生殖细胞中，亲代等位基因可以被独立标记时基因组印记建立。基因组印记的建立发生在印记擦除之后，是表观遗传重组以及整体基因组去甲基化的一部分，对于细胞分化能力必不可少。然而，现在的研究表明当iPSCs来自于分化的体细胞时，在基因重组中可以避免一些生殖细胞特异性重组。在发育中一个重要的疑问是IPSC技术里，重组过程中印记能否被维持。例如，核移植（NT）-克隆的老鼠一般表现出表观遗传不稳定性和LOH，患有各种与印记基因相关的疾病。

这些细胞将来可以被用来研究基础发育过程或用于人类治疗。LOH不仅可以导致早期生长发育障碍，而且与细胞分化和癌症也高度相关。例如H19 Peg1 Peg3，是已知的肿瘤抑制基因。此外，“imprint-free”小鼠ESCs 具有完全的LOH，对于嵌合体发育产生明显的效果。因此，对于IPSCS中印记基因的表达和功能需要仔细研究，这些研究结果对于胚胎干细胞和成体干细胞的印记分析，突出了具有分化能力的多能干细胞群中印记基因功能的重要性。

印记基因与成体干细胞群的维持和功能密切相关。父系peg3表达转基因小鼠显示成体鼠的PEG3在各种组织中的干细胞群中表达受限，包括大脑、肠、骨骼、肌肉和皮肤。神经球的生成，是通过体外神经元分离和扩增技术形成的，在此过程中导致了约100%的PEG3阳性细胞的生成。此外，在表皮移植实验表明转移PEG3阳性细胞在毛囊干细胞壁龛中具有自我更新和分化能力。这些实验表明，PEG3在成体干细胞中起着功能性作用，但目前尚不清楚这些作用是否与早期发育中所体现出的作用不同。

小鼠中，母系表达的H19基因与成人造血干细胞（HSC）群的维持有关。诱导母系HSCs H19/IGF2 ICR删除，可使H19表达减少和IGF2表达增加，同时造血干细胞数目短期内增加，长期减少，逐渐丧失造血潜能和功能。此外，母系H19/Igf2 ICR 的删除通过增加IGF2表达量，降低IGF1r表达量导致IGF2-IGF1R通路的不适当的激活，IGF1r是miR-675的靶位点。这导致由FOXO3介导的细胞周期阻滞相关的静止受到抑制，最终导致活化以及长期HSCs耗尽。此外，研究证实小鼠神经干细胞（NSCs）及其壁龛选择性丢失DLK1印迹对于后天神经形成至关重要。DLK1是Notch信号的膜结合受体，出生后大多数组Notch信号下调。小鼠DLK1缺陷导致慢区分神经干细胞减少，从而导致成人嗅球神经元耗竭。神经干细胞和周围的星形胶质细胞从两个等位基因表达DLK1，而DLK1只从父系等位基因表达。DLK1这种协调双等位基因表达凸显了印记基因调控环境特异性的重要性，以及基因剂量对印记基因的重要性。

本研究中，大鼠骨损伤造模后5d到10d，骨膜反应形成原始骨痂，骨膜下骨祖细胞增殖向成骨细胞分化，骨损伤处有大量间充质细胞聚集。在此期间，实验组H19表达量明显增加且是对照组的两倍，15d到25d基本无变化。在间充质细胞和骨祖细胞等干细胞分化过程中，H19高表达，说明H19参与调控间充质细胞、骨祖细胞分化，其具体机制还不清楚。

4 结论

H19可以促进大鼠骨细胞的增殖与分化，加快损伤部位愈合。

[1] Amano K，Hata K，Sugita A，Takigawa Y，Ono K，Wakabayashi M，Kogo M，Nishimura R，Yoneda T：Sox9 family members negatively regulate maturation and calcification of chondrocytes through up-regulation of parathyroid hormone-related protein[J].Mol Biol Cell，2009，（20）：4541-4551.

[2] Ferguson CM，Miclau T，Hu D，Alpern E，Helms JA.Common molecular pathways in skeletal morphogenesis and repair[J].Ann N Y Acad Sci，1998，（857）：33-42.

苏杭（1993—），女，湖南省邵阳人，硕士研究生，运动人体科学。

姚军威（1990—），男，江苏徐州人，硕士研究生，运动人体科学。