水热法制备CdSe量子点及其在细胞成像上的应用

马诗瑶++罗沙++王艺凝++岳桐++赵丹

摘要：指出了CdSe量子點作为一种新兴的荧光标记纳米材料，被广泛应用于生物医学等领域。提出了一种以亚硒酸钠为硒源，N-乙酰-L-半胱氨酸为稳定剂，采用水热法一步合成高质量水溶性CdSe量子点的新方法。实验考察了反应物的投料比及其加入顺序对CdSe量子点荧光性能的影响，并从中优化CdSe量子点的合成条件，用荧光光谱对CdSe量子点的发光性能进行了表征。选取最佳条件下制备的CdSe量子点标记人肝癌细胞，N-乙酰-L-半胱氨酸修饰的CdSe量子点具有良好的水溶性和生物相容性，能很好地对人肝癌细胞进行荧光成像。

关键词：CdSe量子点；水热法；荧光；细胞成像

中图分类号：R318

文献标识码：A 文章编号：16749944（2017）10022304

1 引言

量子点（quantum dots），是一种由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的，其中Ⅱ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族和Ⅳ-Ⅵ族这三个系列的量子点较为常见， Ⅱ-Ⅵ族量子点由于其制备过程简单，荧光性能优良、光学性质稳定等优势而被广泛用于各领域的科学研究中。

经过多年的研究和改进，量子点的合成方法正在不断地完善。用于生物荧光标记的量子点通常采用胶体化学法来制备，按所用原料不同可分为金属有机溶剂热分解法和水相合成法两种路线。水相合成法相比于金属有机溶剂热分解法具有试剂无毒、价格低廉、实验操作简单、环境友好等优势，且水相法制备量子点无需结构修饰就具有很好的水溶性和生物相容性，这些特性使量子点能很好应用于生物成像的科学研究中。水热法是在特制的密闭反应器（如高压反应釜等）中，通过恒温加热使反应体系在高温高压的环境下反应生成量子点的方法。水热法不但继承和发展了水相法的优点，而且克服了回流法温度不能超过100℃的缺陷，反应温度的提高极大地缩短了量子点的制备时间。水热法还改善了量子点表面缺陷，使量子点的荧光量子产率得到了显著的提高。

量子点在经过适当的结构修饰后，能与细胞表面的分子或肽特异性结合，进而成功地标记靶细胞。1998年Bruchez等人首次成功使用量子点来标记固定细胞，此后经过后人的不断研究，量子点的细胞成像技术不断提高。将量子点引入到活细胞的方式有电穿孔技术、显微注射法，也可以经过细胞自身的内吞作用进入到靶细胞中。量子点相比于传统有机荧光染料具有许多优势，它在生物医学研究中能够解决传统有机荧光染料解决不了的问题，例如量子点的荧光寿命长，漂白性强，这使得用量子点标记的细胞可以在较长的一段时间内进行反复成像，实时监测细胞的动向。量子点具有生物相容性好、低毒等优点使其被广泛应用于细胞成像的研究中。总之，量子点作为新型的荧光探针为生命医学的细胞研究工作提供了强而有力的工具。

2 实验部分

2.1 实验试剂与仪器

2.1.1 实验试剂

柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O，上海展云化工有限公司，分析纯AR）；氯化镉（CdCl2·2.5H2O，国药集团化学试剂有限公司，分析纯AR）；硼氢化钠（NaBH4，国药集团化学试剂有限公司，纯度96%）；亚硒酸钠（Na2SeO3，Xiya Reagent，纯度98%）；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，C5H9NO3S，上海阿拉丁试剂有限公司，纯度99%）；罗丹明-6G（C28H31N2O3Cl，上海阿拉丁试剂有限公司）；人肝癌细胞（HepG2）（购自上海北诺生物科技有限公司）；DMEM高糖液体培养基（海克隆HyClone）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司）；青霉素钠（C18H17N2O4SNa，biosharp）；硫酸链霉素（C42H84N14O36S3，biosharp）；氯化钠（NaCl，国药集团化学试剂有限公司，分析纯AR）；氯化钾（KCl，国药集团化学试剂有限公司，分析纯AR）；磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O，国药集团化学试剂有限公司，分析纯AR）；磷酸二氢钾（KH2PO4，国药集团化学试剂有限公司，分析纯AR）；实验中所用的水均为超纯水。

2.1.2 实验仪器

CP214型电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；DHG-9030型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；LS55型荧光分光光度计（PerkinElmer珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司）；Lambda35型紫外分光光度计（PerkinElmer珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司）；高纯N2（四川天一科技股份有限公司）；ZF-20C暗箱式自动紫外分析仪（上海宝山顾村电光仪器厂）；MF53型倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）。

2.2 实验方法与步骤

2.2.1 CdSe量子点的合成

（1）溶液的配制。Na2SeO3溶液的配制：称取Na2SeO3固体0.0413 g，加5 mL超纯水，所配溶液浓度为0.04 mol/L；柠檬酸钠溶液的配制：称取柠檬酸钠固体0.8000 g，加8 mL超纯水，配制成浓度为10%柠檬酸钠溶液；称取NAC固体30 mg和NaBH4固体80 mg，分别用少量超纯水（<1 mL）溶解。

（2）注射法制备CdSe量子点。称取一定量的CdCl2于50 mL的圆底烧瓶中，加入上述配置的2 mL柠檬酸钠溶液和37 mL超纯水使其混合均匀，在N2的保护下剧烈搅拌30 min。然后用微量注射器分别吸取上述配制好的全部的NaBH4、NAC和0.8 mL Na2SeO3溶液，，并将这三种溶液快速的注射到圆底烧瓶中，继续搅拌5 min，然后将反应液转移至高压反应釜中，200℃反应40 min，即可得高荧光水溶性的CdSe量子点（Cd∶Se∶NAC∶NaBH4的摩尔比为1∶0.1∶0.57∶6.61，[Cd2+]=8mmol/L）。

2.2.2 CdSe量子点的细胞成像

将HepG2细胞在6孔显微板中进行人工培养，其播种密度为每孔2×104个细胞，培养基为DMEM液体培养基，内含10%FBS和100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素。经过48 h的培育后，将培养基倒掉并用pH值为7.4的磷酸缓冲液（PBS）洗1次，然后每孔加入1 mL的固定液（醋酸∶甲醇的体积比为1∶3），5 min后将固定液的倒掉，并用PBS洗2～3次。将少量提纯的CdSe量子点用PBS稀释，并加入到6孔显微板中。将6孔显微板置于荧光倒置显微镜上，采用λ=405 nm的光激发，观察CdSe量子点对HepG2细胞的标记情况，并拍摄荧光成像照片。

2.2.3 CdSe量子点的荧光量子产率测定

CdSe量子点的荧光量子产率采用参比法测定，以罗丹明-6G为标准物质，乙醇为溶剂，根据下面的式子计算：

3 结果与讨论

量子点具有很高的比表面积，量子点的质量主要是由量子点的表面性质决定。其合成条件的改变，如反应温度、反应时间、试剂的比例、稳定剂的类型等都会影响所制备的量子点的结构。为了得到高质量的产物，必须严格控制制备过程的反应条件。实验使用荧光分光光度计来表征CdSe量子点的发光性能。在前期实验的基础上，控制实验反应温度为200℃，反应时间为40 min不变，主要研究反应物投料比以及反应物的加入顺序对量子点发光性能的影响。

3.1 亚硒酸钠的影响

实验固定反应温度200℃，反应时间40 min不变，不改变其他反应物的投入量，仅改变Na2SeO3的用量，探讨了Cd∶Se摩尔比为1∶0.24、1∶0.15、1∶0.10、1∶0.07（[Cd2+]=8 mmol/L）对合成CdSe量子点的影响。当Cd∶Se的摩尔比为1∶0.24时，合成的CdSe量子点无荧光且有沉淀生成，推测可能是由于Se含量相对较多时，量子点表面形成了更多的Se悬键，悬键由于自身的热力学不稳定性容易造成激子的非辐射复合而不利于量子点的发光，因此应减少Na2SeO3的投入量。如图1所示，当Na2SeO3的摩尔比减小到0.15时，CdSe量子点开始出现微弱的荧光，进一步减小到0.10时，CdSe量子点的荧光强度显著上升，这是因为当Se含量减少后，Cd2+-NAC复合物逐渐占据Se位点，这对量子点起到表面态钝化作用，有利于提高CdSe量子点发光效率。但当减小至0.07时，CdSe量子点的荧光降低了，这是由于Se2 的投入量过少，进而造成Cd2+过量，过量的Cd2+会与OH-在溶液中形成CdO·nH2O沉淀，过多的沉淀吸附到量子点表面会不利于光激发。因此，本文将选取Cd∶Se的摩尔比为1∶0.10进行后续的研究。

3.2 稳定剂NAC用量的影响

稳定剂的作用在于钝化量子点的表面缺陷，减少非辐射重组，因而其浓度是影响量子点发光性能的重要因素。固定其余条件不变，只改变NAC的量，实验研究了Cd∶NAC的摩尔比为1∶0.48、1∶0.57、1∶0.67（[Cd2+]=8 mmol/L）时对CdSe量子点的影响。由图2所示，随着稳定剂NAC用量的增加，CdSe量子点的荧光强度表现出先增后降的变化趋势，当Cd∶NAC的摩尔比为1∶0.57时合成的CdSe量子点的荧光最强。本文推测当Cd∶NAC的摩尔比为1∶0.48时，由于没有足够的NAC来包裹CdSe量子点而造成大量的表面缺陷，致使CdSe量子点的发光效率降低，但当Cd∶NAC的摩尔比增加大1∶0.67时，由于稳定剂NAC过多，NAC与Cd2+之间会形成更稳定的二硫配合物，游离的Cd2+减少，而未反应的Se2-浓度增大，并导致更多的表面缺陷以致于CdSe量子点的荧光下降。

3.3 硼氢化钠的影响

在其他条件最佳的情况下，只改变的NaBH4投入量，分别考察了Cd∶NaBH4的摩尔比为1∶5.78、1∶6.61、1∶8.26（[Cd2+]=8 mmol/L）对CdSe量子点荧光强度的影响。由图3所示，随着NaBH4用量的增加，CdSe量子点荧光强度先增加后减小，当Cd∶NaBH4的摩尔比为1∶6.61时，CdSe量子点的荧光强度达到最大。NaBH4作为还原剂，其作用在于将亚硒酸钠中的Se4+还原成Se2-，所以反应前体Se2-的浓度与NaBH4的用量有关。硼氢化钠只有在合理的用量下，才能将亚硒酸钠中的Se4+充分还原成Se2-，提高量子点的质量。

3.4 氯化镉加入的先后顺序的影响

经过前面的研究，筛选出反应物最佳的投料比为Cd∶Se∶NAC∶NaBH4的摩尔比为1∶0.1∶0.57∶6.61（[Cd2+]=8 mmol/L），固定该投料比不变，仅改变CdCl2的加入顺序来研究其对合成CdSe量子点的影响。由图4看出，CdCl2的加入顺序对合成CdSe量子点的影响很大，CdSe量子点的荧光强度以及发射波长均发生了显著地改变。因而，可以通过改变反应物的加入顺序来获得不同颜色的CdSe量子点。

3.5 最佳条件下的CdSe量子点的荧光量子产率

以罗丹明-6G为标准物质，乙醇为溶剂，采用参比法测得CdSe量子点的荧光量子产率为39%。CdSe量子点在545 nm处产生了明显的荧光发射峰，峰型窄且对称，说明在投料比为Cd∶Se∶NAC∶NaBH4的摩尔比为1∶0.1∶0.57∶6.61（[Cd2+]=8 mmol/L）的条件下，合成的CdSe量子点粒径分布较均匀，在365 nm紫外光的激发下，量子点发出明亮的绿色。

3.6 CdSe量子点标记HepG2细胞

實验采用对生物体无毒性的生物小分子NAC替代毒性较大的巯基乙酸或巯基丙酸作为量子点的稳定剂包覆在量子点的表面，使其能够顺利地侵染HepG2细胞，进行细胞成像研究。如图5所示，被CdSe量子点标记的HepG2细胞呈明亮的绿色荧光，细胞轮廓清晰可见，说明CdSe量子点是一种很好的生物荧光成像探针。

4 结论

实验主要对CdSe量子点的合成进行研究并将其应用于细胞成像。在量子点的合成部分，以在空气中稳定的Na2SeO3作為硒源，NAC作为稳定剂，采用水热法一步合成CdSe量子点，操作简单易行。通过改变反应物的投料比以及反应物的加入顺序，优化了CdSe量子点的合成条件。投料比为Cd∶Se∶NAC∶NaBH4的摩尔比为1∶0.1∶0.57∶6.61（[Cd2+]=8 mmol/L），200℃下反应40 min制备得的CdSe量子点光学特性优良、粒径分布均匀、生物相容性好。同时本文成功地将CdSe量子点应用于HepG2细胞成像，为后续的研究奠定了坚实的基础。

参考文献：

[1]

游子涵. 水溶性CdSe量子点的合成及其化学/电致化学发光性质研究[D]. 武汉：华中农业大学，2007.

[2]冯启彪. CdSe量子点的合成、表征及其应用研究[D]. 杭州：浙江大学，2006.

[3]张文豪， 丁俊生. 水溶性的高荧光CdTe/CdSeⅡ型核壳量子点的合成与表征[J]. 无机化学学报，2010（5）.

[4]张丹宁， 李定云， 孙启壮，等. 量子点的制备方法综述与展望[J]. 渤海大学学报（自然科学版），2012（2）.

[5]Bruchez M， Moronne M， Gin P， et al. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels[J]. Science， 1998， 281（38）：2013～2016.

[6]杨玉霞. 量子点在细胞内成像中的应用进展研究[J]. 大家健康（学术版），2014（16）.

[7]秦海燕. 纳米晶的光学性质及其细胞成像和单分子示踪应用[D].杭州：浙江大学，2012

[8]黄 亮. Ⅱ-Ⅵ族量子点及其二氧化硅复合纳米结构的制备与生物成像应用[D]. 武汉：华中农业大学，2013.

[9]王益林，杨 昆，潘华桥，等. 高质量CdSe量子点的水相制备与表征[J]. 高等学校化学报，2012（12）.

[10]Wei C， Li J， Gao F， et al. One-step synthesis of high-quality water-soluble CdSe quantum dots capped by N-acetyl-L-cysteine via hydrothermal method and their characterization[J]. Journal of Spectroscopy， 2015（13）.

[11]谭 华，倪朕伊，皮孝东，等. 硅量子点在光电器件中的应用研究进展[J]. 激光与光电子学进展， 2017（3）.

[12]于 璇.量子点电视：进击的“宠儿”[J]. 电器， 2015（2）.

[13]乔 毅，冯雪元，张家雨，等.量子点发光材料在多色照明上的应用[J]. 照明工程学报，2006（1）.

[14]李文杰，钟新华. 预先合成量子点组装制备高效量子点太阳电池[J]. 物理学报，2015（3）.

[15]马 娟，宋凤丹，陈 昊，等. 量子点敏化太阳能电池研究进展[J]. 化工进展， 2015（10）.

[16]张向东，尹世忠. 电磁场下量子点中的电子态[J]. 河北师范大学学报，1996（2）.

[17]冯志芳.电子在三个耦合量子点中输运的主方程[J]. 和田师范专科学校学报， 2005（5）.

[18]郑皓源.量子点敏化太阳能电池研究进展[J]. 化工技术与开发，2015（3）.

[19]李玉现，刘建军，李伯臧. 量子点接触中的电导与热功率：磁场与温度的影响[J]. 物理学报，2005（3）.

[20] 闭伟鑫，王志亮，李 颖，等. 油溶性及水溶性碳量子点敏化太阳能电池性能[J].南通大学学报（自然科学版），2014（2）.

[21]张太宏，云斯宁，李 晶，等. 染料敏化太阳能电池合金对电极材料[J]. 科学通报， 2016（Z1）.

[22]白宇冰，王秋莹，吕瑞涛，等. 钙钛矿太阳能电池研究进展[J]. 科学通报， 2016（Z1）.

[23]靳斌斌. 量子点敏化太阳电池光阳极研究进展[J]. 当代化工. 2016（2）.

[24]何章凯，王多发，陈高玲，等. 量子点敏化太阳能电池TiO2光阳极研究进展[J]. 材料导报， 2016（3）.

[25]梅海林，唐立丹，王 冰，等. 钙钛矿型太阳能电池的研究进展[J]. 辽宁工业大学学报（自然科学版）， 2016（1）.

[26] 朱立峰，石将建，李冬梅，等. 多孔TiO2层厚度对钙钛矿太阳能电池性能的影响[J]. 化学学报， 2015（3）.

[27]郑皓源. 量子点敏化太阳能电池研究进展[J]. 化工技术与开发， 2015（3）.

[28]张秀清，李艳红，张 超. 太阳能电池研究进展[J]. 中国材料进展， 2014（7）.

[29]杨健茂，胡向华，田启威，等. 量子点敏化太阳能电池研究进展[J]. 材料导报， 2011（23）.

[30]于哲勋，李冬梅，秦 达，等.染料敏化太阳能电池的研究与发展现状[J]. 中国材料进展， 2009（Z1）.