不同分子量壳聚糖对高脂膳食小鼠血糖的调节作用

张思聪 - 夏文水 - 王 斌,3 ,3 杨 硕

(1. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2. 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；3. 江苏海隆国际贸易有限公司，江苏 淮安 223005)

不同分子量壳聚糖对高脂膳食小鼠血糖的调节作用

张思聪1,2ZHANGSi-cong1,2夏文水1,2XIAWen-shui1,2王 斌1,2,3WANGBin1,2,3杨 硕1,2YANGShuo1,2

(1. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2. 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；3. 江苏海隆国际贸易有限公司，江苏 淮安 223005)

为研究不同分子量壳聚糖对高脂膳食小鼠血糖的调节作用，选取C57BL/6J雄性小鼠48只，随机分为4组：正常组(Control)、高脂组(high fat，HF)、低分子量壳聚糖组(high fat+low weight molecular chitosan， HF+LWMC)和高分子量壳聚糖组(high fat+high weight molecular chitosan，HF+HWMC)。每周记录其摄食量和体重。饲养16周后，对小鼠血清、肝脏的生化指标进行测定，并对肝脏磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate carboxybinase，PEPCK)及葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose 6 phosphatase，G6Pase)的基因表达进行检测。结果表明：壳聚糖的添加可降低高脂膳食小鼠的体重和血脂水平，缓解肝脏脂质过氧化，高分子量壳聚糖的效果略好于低分子量壳聚糖。

壳聚糖；高脂膳食；降血糖

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由多种致病因素引起的一种以慢性高血糖为特征的代谢紊乱综合征，现已逐渐发展为全世界严重的公共卫生问题，成为人类疾病的第三位死亡病症。糖脂代谢紊乱在Ⅱ型糖尿病的发生与发展中起重要作用，而且糖、脂代谢紊乱常常互相影响，形成恶性循环[1]。肥胖是一些慢性疾病的主要病因，易导致血脂异常、肝脂肪变性和Ⅱ型糖尿病等疾病[2]。一些研究[3-5]发现肥胖和Ⅱ型糖尿病的易致病基因与环境因素有一定关系。预计在2010～2030年，发展中国家的糖尿病成年人患病者会增加69%，发达国家会增加20%[6]。用于辅助治疗糖尿病的药物或多或少带有副作用，促使人们寻找高效的天然活性成分。壳聚糖(chitosan，CS)是天然多糖中唯一的阳离子聚合多糖，是一种丰富的可再生资源[7-9]，主要存在于贝类、蛤、牡蛎、磷虾和真菌中[10-11]，因其具有一些独特的生物活性[12-15]，被广泛应用于生物医药、食品工程等领域[16-18]。据报道[19-20]，壳聚糖可以在肠胃中形成胶状黏性纤维，延缓胃排空，降低糖吸收速度，增加周围组织对胰岛素的敏感性。目前已发现壳聚糖具有降血脂、降血糖等生物学功能[21]，但其具体机制尚不完全清楚，且大部分试验采用STZ造模，并没有完全模仿人们的膳食习惯。本研究拟通过给小鼠摄食不同分子量壳聚糖，比较分析LWMC和HWMC对小鼠生化指标及基因表达的影响，探讨不同分子量壳聚糖对小鼠血糖调节的影响，进一步探讨壳聚糖对高脂膳食机体的氧化还原状态、糖异生水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

壳聚糖：平均分子量分别为48，510 kDa，浙江金壳生物化学有限公司；

总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、胰岛素试剂盒：南京建成生物工程研究所；

Oligo(GAPDH、PEPCK、G6Pase)：上海桑尼生物科技有限公司，引物序列见表1；

Prime ScriptTMRT Master Mix、SYBR®Premix Ex TaqTMII试剂盒：宝生物工程 (大连) 有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

冷冻型大容量离心机：4K15型，德国Sigma公司；

紫外可见分光光度计：UV-1800型，日本岛津公司；

血糖仪：ACCU-CHEK Active型，罗氏诊断产品(上海)有限公司；

酶标仪：M5型，美国Molecular Devices公司；

表1 RT-qPCR引物序列†Table 1 The sequence of the primers for RT-qPCR

† F: Forward primer 正向引物；R: Reversed primer 反向引物。

One-drop spectrophotometer：OD-1000型，上海采邑生物科技有限公司；

实时荧光定量PCR仪：Step One Plus型，美国应用生物系统公司。

1.2 动物试验设计

取4周龄C57BL/6J雄性小鼠48只，预饲养7 d后，根据体重随机分为4组：对照组(Control，D12450B)，高脂组(HF，D12451)，高脂+低分子量壳聚糖组(HF+LWMC)，高脂+高分子量壳聚糖组(HF+HWMC)，壳聚糖均添加于饲料中。D12405B、D12451饲料配方见表2。小鼠自由进食进水。每周对小鼠体重进行记录，并对其饮水量及进食量进行记录和分析，每4周对其血糖水平进行测定。环境温度控制在(22±2) ℃，湿度60%，小鼠饲养16周后处死。

表2 正常、高脂饲料配方†Table 2 Compositions of control and high-fat diet g

† a. 矿物质混合物S10026(g/kg混合物)：氯化钠259，氯化镁 41.9，七水合硫酸镁257.6，四水合钼酸铵 0.3，硫酸铬钾 1.925，碳酸铜 1.05，柠檬酸铁 21，碳酸锰 12.25，碘酸钾 0.035，氟化钠 0.2，亚硒酸钠 0.025，碳酸锌 5.6。 b. 维生素混合物V10001(g/kg混合物)：维生素A 11.07，维生素D 9，维生素E 90，维生素K33.774，维生素H 9，维生素B120.9，维生素B 1.8，烟酸 27，泛酸钙 14.4，维生素B66.3，维生素B26.75，维生素B15.4。

1.3 血液及组织样本的采集

小鼠饲养16周后禁食12 h，乙醚麻醉后摘眼球取血，所得血液于4 ℃、4 000 r/min条件下离心10 min，取上层血清-80 ℃保存待用。断颈处死小鼠后，取肝脏等组织在预冷的生理盐水中漂洗除去附着的血液，滤纸吸干后称重，所得组织保存于-80 ℃备用。

1.4 指标的检测

1.4.1 血糖的检测 在第0、4、8、12、16周时，小鼠隔夜禁食12 h，对其尾部取血，测定其血糖含量。

1.4.2 血清和肝脏组织中指标的测定 使用试剂盒测定血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、胰岛素含量以及肝脏中总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。

1.4.3 肝脏中RNA的提取 取100 mg肝脏组织置于1 mL Trizol中，对肝脏组织进行破碎，加200 μL氯仿震荡，静置；12 000 r/min，4 ℃下离心15 min，取上清200 μL，加异丙醇200 μL震荡，静置5 min；12 000 r/min，4 ℃下离心15 min，弃上清，加入100%乙醇1 mL，12 000 r/min，4 ℃下离心7 min，弃上清后再加入75%乙醇1 mL，12 000 r/min，4 ℃下离心7 min，弃上清；加入DEPC水50 μL，待完全溶解后，使用one-drop spectrophotometer测定RNA浓度。

1.4.4 qRT-PCR 按照试剂盒说明书，将提取的RNA反转录为cDNA，使用SYBR Green Mix进行基因扩增检测，其扩增程序为：95 ℃变性30 s；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min为第一个循环，共40个循环。检测各模板的Ct值，并通过其进行相对定量分析。

1.4.5 数据处理与统计分析 运用SPSS 17.0软件进行数据的显著性检验分析，结果以means±SD表示。

2 结果与分析

2.1 对高脂膳食小鼠体重和摄食量的影响

由表3可知，饲养前各组小鼠之间体重无显著性差异，试验结束时高脂组小鼠体重有显著的增加(P<0.05)。而在整个饲养过程中，各组小鼠的摄食量并不存在显著性差异，即高脂饲料并未引起小鼠摄食量的变化，由此可以说明高脂饲料组中小鼠体重的增加是由于高脂饲料中脂肪含量的增加引起的，与摄食量无直接关系。与高脂组比，高分子量壳聚糖组小鼠体重的差异性强于低分子量壳聚糖组。含壳聚糖组小鼠体重增加量均显著低于高脂组小鼠。高脂组小鼠的食物效应率显著高于其他组(P<0.05)。高分子量壳聚糖在减少体重和降低食物效应率方面的作用略好于低分子量壳聚糖。

2.2 对高脂膳食小鼠血糖的影响

由表4可知，饲养前各组小鼠血糖水平差异不大。在饲养期间，正常组血糖水平一直较稳定，高脂组小鼠血糖持续增加，12周开始较正常组显著增加(P<0.05)。含壳聚糖组小鼠的血糖较正常组也有缓慢上升，但增加速度与高脂组相比较为缓慢。说明高脂膳食致小鼠血糖调节受损，血糖升高，从而引起糖代谢紊乱。由试验结果可知壳聚糖对高脂膳食小鼠的血糖有降低作用。高分子量壳聚糖对血糖的调节作用略好于低分子量壳聚糖。

2.3 对高脂膳食小鼠血脂和胰岛素水平的影响

由表5可知，与正常组相比，高脂组的TC、LDL-C水平显著升高(P<0.05)，HDL-C水平显著降低。与高脂组相比，高分子量壳聚糖组的TC含量有明显降低。壳聚糖组的LDL-C，HDL-C水平均与高脂组有显著性差异(P<0.05)。4组的TG水平无显著差异。壳聚糖组的胰岛素含量较高脂组显著升高(P<0.05)。

高脂组小鼠血脂水平增加，壳聚糖可降低血脂水平，减少肝脏脂质过氧化水平，缓解肝脏脂肪变性。高脂膳食导致血清中TC水平升高，壳聚糖组TC、TG含量较高脂组有所降低，但对TG含量的降低作用没统计学意义。这与壳聚糖具有抗肥胖、降低血脂作用相吻合。同时，高分子量壳聚糖的氧化还原指标略优于低分子量壳聚糖。

表3 不同分子量壳聚糖对高脂膳食小鼠体重和摄食量的影响†Table 3 Effects of chitosan with different molecular weight on the body weight and the diet intake of high-fat diet fed mice (n=8)

† *表示与正常组比较，P<0.05；#表示与高脂组比较，P<0.05；食物效应率为体重增加量与摄食量的比值。表4 不同分子量壳聚糖对高脂膳食小鼠血糖水平的影响†Table 4 Effects of chitosan with different molecular weight on the blood glucose of high-fat diet fed mice (n=8) mmol/L

† *表示与正常组比较，P<0.05；#表示与高脂组比较，P<0.05。

表5 不同分子量壳聚糖对高脂膳食小鼠血脂和胰岛素的影响†Table 5 Effects of chitosan with different molecular weight on the plasma lipid levels and insulin levels of high-fat diet fed mice (n=8)

† *表示与正常组比较，P<0.05；#表示与高脂组比较，P<0.05。

2.4 对高脂膳食小鼠肝脏氧化还原状态的影响

目前有报道[22]指出，糖尿病肝损伤的发生率在10%～30%。糖尿病与肝脏相关代谢异常主要表现为糖、脂代谢紊乱。MDA作为脂质过氧化的终末产物，直接反应氧化应激水平[23]。抗氧化酶是机体抗氧化系统中的重要组成部分，包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)等。SOD可通过清除ROS、分解过氧化产物等保护机体抵御氧化应激。

由表6可知，壳聚糖的添加能够增加高脂膳食小鼠CAT活性，但差异不显著(P>0.05)。高脂组肝脏MDA含量显著增加(P<0.05)，壳聚糖添加后能够显著降低肝脏MDA含量(P<0.05)。由表6还可知，和正常组相较而言，高脂组小鼠的肝脏的SOD和T-AOC活性有显著降低(P<0.05)。添加壳聚糖以后，其SOD和T-AOC活性较高脂组显著升高(P<0.05)，说明壳聚糖能够显著增加肝脏抗氧化能力，减少肝脏脂质过氧化，并且高分子量壳聚糖的作用效果好于低分子量壳聚糖组。以上结果表明壳聚糖可明显改善氧化应激水平，可能为其改善糖尿病肝损伤的机制之一。

表6 不同分子量壳聚糖对高脂膳食小鼠肝脏氧化还原状态的影响†Table 6 Effects of chitosan with different molecular weight on the liver antioxidant index of high-fat diet fed mice (n=8)

† *表示与正常组比较，P<0.05；#表示与高脂组比较，P<0.05。

2.5 小鼠肝脏基因检测结果

PEPCK能够促进草酰乙酸生成磷酸丙酮酸，是糖异生途径的限速步骤。G6Pase能够催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖，是糖异生途径的最后步骤[24-25]。G6Pase在糖尿病的病因学和生理学中均有重要的作用，已经成为糖尿病治疗的一个潜在靶点[26]。

分别用Real-Time PCR 方法对小鼠肝脏中糖异生关键酶PEPCK及G6Pase的基因表达进行检测(见图1)，检测结果显示，与正常组相比，高脂组小鼠肝脏PEPCK 和 G6Pase 基因水平均显著增高(P<0.05)，说明高脂组小鼠肝糖异生作用异常，肝脏葡萄糖输出明显增多，导致空腹血糖升高。与高脂组小鼠相比，添加壳聚糖组的小鼠PEPCK与G6Pase基因表达有显著下调(P<0.05)。壳聚糖可有效降低肝脏PEPCK和G6Pase的基因表达水平，与之前研究结果相同[27-28]，抑制肝脏组织糖异生，降低空腹血糖。高分子量壳聚糖对PEPCK基因表达的调节作用优于低分子量壳聚糖。

3 结论

本试验通过对高脂膳食C57BL/6J小鼠研究、比较不同分子量壳聚糖的降血糖作用。结果表明高脂膳食对小鼠的体重、血脂、血糖以及糖代谢相关基因都有显著的影响。壳聚糖可以缓解高脂膳食带来的机体损伤，降低体重增加速度、血脂、血糖，下调糖代谢相关基因的表达。本研究为辅助降血糖功能性食品的研究提供了依据，为开发健康、安全、无毒副作用的辅助降血糖功能食品开辟了道路，然而其调节血糖的作用机理还有待进一步研究。

图1 C57BL/6J小鼠肝脏组织PEPCK、 G6Pase mRNA 检测结果Figure 1 The mRNA expression of PEPCK and G6Pase in liver of C57BL/6J mice

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The glucose regulation effect of different molecular weight chitosan on mice fed high-fat diet

(1.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China;2.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,Wuxi,Jiangsu214122,China;3.JiangsuHiLongInternationalTradingCo.,Ltd,Huai’an,Jiangsu223005,China)

In order to compare the glucose regulation effect of different molecular weight chitosan on mice fed high-fat diet, 48 male C57BL/6J mice were randomly assigned to four groups, The control group (Control), which consumed a normal diet, The HF group (HF), which was fed with a high-fat diet, The HF+LWMC and HF+HWMC groups, which were fed with a high-fat diet supplement with 5% low weight molecular chitosan and 5% high weight molecular chitosan, respectively. The diet intake and weight data were collected weekly. The biochemical indicators of serum and liver and the gene expression of PEPCK and G6Pase were determined at the end of the 16 week. The results indicated that supplementation of chitosan could reduce body weights, decrease the levels of serum lipid, and alleviate the liver lipid peroxidation of HF mice. Also, high weight molecular chitosan showed better hypolipidemic effect than low weight molecular chitosan.

chitosan; high-fat diet; hypoglycemic action

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.024