穿心莲内酯对小鼠睾丸组织形态及NO、iNOS的影响

戴伟娟+徐丽娟+王旭+刘艳华+朱凡河�í�

【摘要】目的：观察穿心莲内酯对小鼠睾丸组织形态及NO、iNOS的影响。方法：取体重25±3g昆明种雄性小鼠，随机分为5组：生理盐水组、穿心莲内酯低、中、高3个剂量组（667、200、600mg/kg）、雷公藤组（60mg/kg），连续灌胃给药60d。给药结束后，处死小鼠，取睾丸，常规制备组织切片，观察睾丸组织的形态学变化，并计数生精细胞层数和数量。制备10%的组织匀浆，分别用硝酸还原酶法、化学比色法测定睾丸组织中NO浓度及iNOS活力。结果：与生理盐水组相比，光镜下可见穿心莲内酯三剂量组及雷公藤组，小鼠睾丸曲细精管发生不同程度的管壁变薄，生精细胞数量减少，排列疏松，不规则，成熟的精子较少。睾丸组织中iNOS活力降低，NO的含量减少。结论：长期服用穿心莲内酯产生的抗雄性生育作用与抑制iNOS活力，减少NO的生成有关。

【关键词】 穿心莲内酯；睾丸；NO；iNOS

【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）11-0052-04

The Effect of Andrographolide on Testicular Tissue Morphology and NO，iNOS in Mice

DAI Weijuan1XU Lijuan2WANG Xu1LIU Yanhua1ZHUFanhe

1.Department of Pharmacology，Jining Medical University，Jining 272067，China2. People's Hospital of Jinxiang County， Jinxiang 272200，China

Objective To observe the effect of histological changes and iNOS，NO in mice testes submitted to Andrographolide. Methods Male Kunming mice of weight 25±3g were randomly divided into 5 groups：saline group， Andrographolide low dose group， middle dose group ，high dose group and Tripterygium wilfordii group. Drugs were given by gavage once a day for 60 days. After getting testicles out of mouse killed， tissue slices and homogenate were made for observing morphologic changes of testicular tissue，and count the layer number and the quantity of sperm cells. Measuring respectively changes of iNOS，NO by nitrate reduction enzymatic and chemical colorimetric method.Results In three dose groups of Andrographolide and Tripterygium wilfordii， compared with normal saline group， mice testicular seminiferous tubule wall become thinning， and lumen become bigger in different degrees， the decrease in the number of sperm cells （loosely arranged and irregular） were observed. The number of mature sperms decreased and iNOS activity decreased， NO concentration reduced. Conclusion If Andrographolide is taken for long term， the mechanism of Andrographolide resistance to male reproductive function is related to inhibition of iNOS vitality and reduction of the generation of NO.

Andrographolide；Testes；NO；iNOS

穿心蓮内酯（Andrographolide）又名穿心莲乙素，是穿心莲的主要有效成分之一，具有清热解毒、凉血消肿的功效。药理研究表明，穿心莲内酯具有解热抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓、抗糖尿病、免疫调节、保肝利胆等作用[1]。国外研究发现，穿心莲内酯有阻止精子生成、影响精子的活力与结构的作用[2]。前期研究发现，穿心莲内酯体内外给药，对大鼠精子、胚胎及小鼠精子形成均有明显影响，可使胚胎发育异常，精子数量和存活率降低[3]。为进一步探讨穿心莲内酯对睾丸组织的毒性作用及可能机制，实验在前期工作的基础上，观察了睾丸组织的形态学改变，检测了小鼠睾丸组织中NO和iNOS的变化，为阐明穿心莲内酯的生殖毒性机理提供依据。

1仪器与材料

11实验动物昆明种小鼠，雄性，体重（25±3）g，由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（鲁）20130001。

12药品穿心莲内酯片（批准文号：国药准字Z370200500，山东方健制药有限公司，标示量0105g）；雷公藤多甙片（批准文号：Z31020415，上海复旦复华药业有限公司，标示量10mg）；将穿心莲内酯片和雷公藤多甙片研碎，用生理盐水分别配制成穿心莲内酯667mg/mL、20mg/mL、60mg/mL，雷公藤6mg/mL。

13试剂总蛋白定量测试盒（批号：20120426）、一氧化氮测试盒（批号：20120428）、一氧化氮合酶测试盒（批号：20120429）均由南京建成生物有限公司提供。

14仪器T10 basic IKA匀浆机（北京萌壮科技有限公司）；DK-600S型三用恒温水箱（上海精宏实验设备有限公司）；LDZ5-2低速自动平衡离心机（北京医用离心机厂）；UV754N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

2方法

21实验方法 随机将小鼠分为5组：生理盐水组、穿心莲内酯低（667mg/kg） 、中（200mg/kg）、高（600mg/kg）剂量组、雷公藤组（60mg/kg），每只小鼠按01mL/10g灌胃给药连续60d。7d称重一次，调整剂量。给药结束2d后，处死小鼠，取一侧睾丸，4%甲醛固定，常规制备组织切片，HE染色，观察睾丸组织曲细精管的形态学变化，并计数每只小鼠10个曲细精管的生精细胞层数和数量。取另一侧睾丸，制备10%的组织匀浆，用硝酸还原酶法测定睾丸组织中NO浓度，化学比色法测定睾丸组织中iNOS活力。检测过程严格按照试剂盒说明书的操作要求，

22统计学处理数据采用SPSS 130 进行处理，以均数加减标准差（x±s）表示，各组间比较先进行单因素方差分析，如果方差齐用LSD检验法，如果方差不齐用Dunett-t检验法进行组间两两比较，P<005为差异有统计学意义。

3结果

31对小鼠睾丸组织形态学的影响光学显微镜下（HE 低倍镜10×）观察发现，生理盐水组小鼠睾丸曲细精管形态正常，管壁完整较厚，各级生精细胞层次清晰，排列紧密，规则有序，胞体充盈，有些可看到成熟的精子，且腔内未见脱落细胞；不同剂量的穿心莲内酯组及雷公藤组，小鼠睾丸曲细精管发生不同程度形态变化，管壁变薄，管腔变大，各级生精细胞排列紊乱，层次不清，数量少而稀松，很难看到成熟的精子。[JP]生精细胞层数，各给药组与生理盐水组相比有统计学差异（P<005）。生精细胞总数，与生理盐水组比较，穿心莲内酯中剂量、高剂量及雷公藤组差异有统计学意义（P<005），低剂量组无统计学意义（P<005）；而与雷公藤组相比，低剂量和中剂量组有统计学差异（P<005），高剂量组无统计学差异（P>005），结果见图1、表1及表2。

32对小鼠睾丸组织中NO浓度的影响与生理盐水组相比，穿心莲内酯各组及雷公藤组小鼠睾丸组织中NO含量均降低，低、高剂量组有统计学差异（P<005）。其中穿心莲内酯高剂量组降低最为明显，而中剂量组虽低于生理盐水组，但无统计学差异（P>005）。穿心莲内酯各剂量组与雷公藤组相比无统计学差异（P>005）。见表3。

33对小鼠睾丸组织中iNOS活力的影响与生理盐水组相比，雷公藤组睾丸组织内iNOS活力明显降低，有统计学差异（P<005）；穿心莲内酯各剂量组睾丸组织中iNOS活力也有所降低，有统计学差异（P<005）。与雷公藤组相比，穿心蓮内酯各组iNOS降低程度均低于雷公藤给药组，但无统计学意义（P>005）。见表4。

4讨论

睾丸是雄性生殖系统的重要器官，其功能是分泌雄性激素及产生精子，它易受温度、化学物质及药物的影响，使精子的产生发生障碍。本研究用穿心莲内酯连续给小鼠灌胃60d，取睾丸切片HE染色后，光镜下观察发现，生理盐水组曲细精管形态结构完整，生精细胞的层数和数量较多，排列规则紧密，管腔内可见有精子的形成，而穿心莲内酯3个剂量组，可看到小鼠睾丸曲细精管生精上皮变薄、管腔有不同程度的增大，生精细胞排列松散而不规则，层数及总数量减少，很少有成熟的精子，各给药组生精细胞层数与生理盐水组相比，其差异性有统计学意义（P<005），各级生精细胞总数与生理盐水组相比，除低剂量组外，均有统计学差异（P<005）。雷公藤所导致的睾丸组织形态学改变与穿心莲内酯组基本一致，但各级生精细胞数量减少较为明显，与穿心莲内酯3个剂量组相比，仅高剂量组无统计学差异（P>005），其余两组均有统计学差异（P<005）。结果表明穿心莲内酯的抗雄性生育作用部位是在睾丸，干扰了睾丸曲细精管的生精过程等功能。当剂量较低时对小鼠生精细胞的影响不如60mg/kg的雷公藤多甙，达到一定用量时也能产生与雷公藤多甙相同的抗雄性生育效应。

一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一种具有广泛生物学活性的气体信使分子，由NOS催化 L -精氨酸生成，参与体内多种生理或病理过程。研究发现，NO、NOS也存在于哺乳动物的雄性生殖系统内，对睾丸的微循环、睾酮的分泌、精子的发生、成熟及活动等起着双向调节作用，生理范围内NO有助于男性生殖系统的发育及功能的发挥，这主要取决于睾丸组织中的NO浓度和NOS的活性。iNOS是诱导型NOS，通常是在受到刺激时才可表达。但研究发现，iNOS在正常睾丸中如间质细胞、生精小管内的支持细胞、不成熟精子头部和管周类肌细胞均有表达，提示它可能参与了正常支持细胞和精子发生过程的调节[4-7]。本研究结果表明，在正常小鼠睾丸组织中检测到iNOS的存在，其活力为（221±124）U/mg·prot，穿心莲内酯连续给药60d，各剂量组均可使睾丸组织中iNOS活性受到抑制，最低到（111±048）U/mg·prot，减少了近一半。NO的含量亦明显减少，由正常小鼠的（420±223）μmol/L最低降到（228±127）μmol/L，从结果看没有明显的剂量依赖性，低剂量与高剂量作用明显，与生理盐水组相比有统计学差异（P<005）。中剂量与生理盐水组相比，NO虽有所降低但无统计学差异其原因可能是多方面的，有待进一步的研究探讨。结果表明穿心莲内酯可通过抑制这些部位的iNOS活性，导致NO的生成减少，这与徐芳芳、刘俊等体内外给穿心莲内酯抑制iNOS表达和NO产生的结果相一致，但它是否对另外两型NOS有影响仍需做进一步的研究[8-9]。前期的研究发现，穿心莲内酯可使精子的数量减少，发育畸形、活动能力减弱等[2-3]，可推测其机制与穿心莲内酯抑制iNOS活性，减少了ON的生成，其含量低于正常生理水平，使NO介导的正常生理状态下的信号转导受到限制，干扰了睾丸组织的正常发育，睾酮的分泌等，使精子数量、成熟度等受到抑制，这种机制与新型植物生长调节剂增产菊胺酯、氯化镉、醋酸铅及二硫化碳的生殖毒性机理基本一致[10-12]。另外，实验发现穿心莲内酯连续给小鼠60d，血中睾酮的水平明显降低。

雷公藤具有抗炎和免疫调节作用，临床用于自身免疫性疾病，也是新型雄性抗生育药，研究显示，大剂量雷公藤片用药第 3、4周末NO S阳性睾丸间质细胞的数量略有减少，染色变淡[11]，可下调eNOS的表达[13]。实验发现雷公藤多甙片能降低睾丸组织中iNOS活性，减少NO的含量，与生理盐水组比有统计学差异（P<005），但与穿心莲內酯组相比无统计学差异（P>005），为进一步研究雷公藤对雄性生殖系统的毒性机制提供了新思路。

综上，穿心莲内酯具有抗雄性生育作用，提示对生育期的男性尽量不要使用含有穿心莲内酯的制剂，也可考虑将其作为一种男性避孕药开发使用。

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（收稿日期：2017-04-04编辑：程鹏飞）