紫外联合红外光谱指纹图谱整合评价三黄片质量

王燕，孙国祥

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理671000；2.沈阳药科大学药学院，沈阳110016）

紫外联合红外光谱指纹图谱整合评价三黄片质量

王燕1,2，孙国祥2*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理671000；2.沈阳药科大学药学院，沈阳110016）

目的：整合评价不同来源的30批三黄片样品质量。方法：建立三黄片紫外指纹图谱和红外指纹图谱检测方法，将两种分析方法结果取均值整合后评价样品质量。结果：整合后的大部分样品质量等级均在合格范围内（质量等级≤5）。结论：任何一种检测方式都具有单一片面性，不能全面表征样品真实质量，需采用多种分析方法并用、全方位整合的技术手段才能客观综合地对其进行质量评价，为中药在其复杂组分未完全分离的情况下，提供了一种简捷快速、全面客观的定性定量质控研究方法。

三黄片；紫外指纹图谱；红外指纹图谱

三黄片由医圣张仲景《金匮要略》中经典名方“三黄泻心汤”衍化而来，收载于历版《中国药典》。组方由大黄、黄芩浸膏和盐酸小檗碱组成，主要成分为蒽醌类、黄酮类和生物碱类化合物，具备抗炎、抑菌、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性，拥有泻火通便、清热解毒等功效，因用于治疗咽喉肿痛、口鼻生疮、尿黄便秘、牙龈肿痛〔1〕等症而被临床广泛应用。目前，对其质量控制的文献报道主要集中在某一个或某几个成分的定量分析以及定性指纹图谱研究方面〔2-11〕，众所周知，仅采用单一或少数几个指标成分进行检测不足以表征中药尤其是复方制剂整体质量。随着科学技术的迅猛发展和现代分析技术手段的不断提高，许多专家学者指出，中药质量应以中医药理论为指导思想，以中药整体观为基础，体现多种分析技术检测相结合的控制模式。

中药指纹图谱分析方法大多数以色谱指纹图谱为主，而光谱指纹图谱，如紫外指纹图谱和红外指纹图谱因样品前处理简单、分析时间较短，检测成本低廉等特点受到广大分析工作者的日益关注。紫外光谱反映样品中不饱和化学键（如双键、三键、共轭体系及杂原子成分）的特征规律信息，常用于植物种类的分类判别、相似度评价或质量一致性研究等，红外光谱反映的是样品中化学键振动转动而产生的特征信息，具备信息量丰富且具有特征性和指纹性等特点，因此光谱指纹图谱可以辅助色谱指纹图谱从整体上实现对中药质量的控制。

综上考虑，笔者从多种分析方法联合、多维信息获取、全方位整合、优势互补的角度出发，建立三黄片样品紫外指纹图谱和红外指纹图谱，将两种分析方法结果平均整合后，评价30批样品质量，力求简捷准确地反映其化学物质的整体含量特征，为该中药制剂的质量分析提供一种全面合理的检测手段。

1 材料

1.1 仪器Agilent1100型液相色谱仪（配有DAD检测器，低压四元梯度泵，在线脱气装置，自动进样器）；Chemstation工作站（Agilent科技有限公司）；Sarturius-BS110S分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；BRUKER IFS55型红外分光光度仪（瑞士布鲁克公司）；AG285电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.2 试药来自19个厂家的30批三黄片样品均购自沈阳各药店（编号S1～S30），样品信息见表1；色谱级甲醇购于山东禹王实业有限公司；其他试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。

表1 30批三黄片样品来源信息

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 紫外指纹图谱分析聚四氟乙烯管（650 mm× 0.12 mm），柱温：（30.0±0.15）℃，流动相：甲醇，流速：0.8 mL∕min，进样量：0.2μL。检测波长：190～400 nm（DAD检测器）。

2.1.2 红外指纹图谱分析Bruker IFS-55型傅立叶红外分光光度仪；DTGS型检测器；波数范围为4 000～400 cm-1；升温速度为2℃∕min；扫描速度为20次∕s；分辨率为8 cm-1。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 紫外指纹图谱分析取本品数片，除去包衣，研细（过三号筛），取约0.3 g，精密称定，加95%乙醇20 mL回流提取2次，每次各1 h，合并滤液，减压浓缩至约20 mL，用95%乙醇定容至25 mL，摇匀，即得供试品溶液。

2.2.2 红外指纹图谱分析取本品1片，除去包衣并研磨成极细粉（过200目筛），取约1 mg，置玛瑙研钵中，加入干燥的KBr极细粉约200 mg，充分研磨混匀，转移至模具中，使平铺均匀，制成透明供试片后置于样品光路中，扣除用同法制成的空白KBr片的背景干扰，记录相应光谱图。

2.3 线性定量指纹法原理在色谱条件固定的前提下，色谱峰面积在一定程度上与样品组分含量呈线性关系〔12〕，故中药复杂化学体系定量研究具有线性属性关系。线性定性相似度SL见公式1。用以表征样品指纹图谱与对照指纹图谱所含化学成分在整体指纹数量和分布比例上的相似程度，其中r和r′分别为线性回归方程中正向相关系数和反向相关系数；线性定量相似度ML见公式2。用以表征样品指纹图谱与对照指纹图谱所含化学成分整体含量的相似程度，其中b为线性回归方程中的斜率，a为误差项，另外，指纹均化性变异系数α见公式3，也用来表征样品指纹图谱与对照指纹图谱的信号分布均一程度。因此，采用SL、ML和α相结合综合评价中药及其制剂整体质量水平的方法称为线性定量指纹法，据此可将中药质量等级划分为8级。等级越高的样品，其质量越差。见表2。

2.4 三黄片紫外指纹图谱的建立和评价

2.4.1 方法学考察精密度试验：取S2样品，按“2.2.1”制备1份，按“2.1.1”检测条件连续进样6次，以254 nm非分离色谱图考察精密度，计算保留时间和峰面积RSD均分别小于1.0%和3.0%，表明检测系统稳定，精密度良好。

表2 线性定量指纹法质量等级评价标准

稳定性试验：取S2样品，按“2.2.1”制备1份，分别在样品制备后0、2、4、8、12和24 h，按“2.1.1”检测条件进样测定，以254 nm非分离色谱图考察稳定性，计算保留时间和峰面积RSD均分别小于1.0%和3.0%，表明供试品溶液在24 h内较稳定。

重复性试验：取S2样品，按“2.2.1”制备6份，按“2.1.1”检测条件进样测定，以254 nm非分离色谱图考察重复性，计算保留时间和峰面积RSD均分别小于1.0%和3.0%，表明本方法重复性良好。

2.4.2 紫外指纹图谱的建立将30批三黄片样品依次进样检测，记录190～400 nm在线紫外光谱图，见图1A，在210～230 nm，260～300 nm紫外吸收信号较强，提示黄酮及其苷类，蒽醌类的紫外光谱特征。将样品信号导入自主研发的“中药光谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0”软件，以各数据点为计量单元按均值法生成对照指纹图谱并根据线性定量指纹法计算各样品SUV、MUV和αUV值，所得质量结果见表3。

2.4.3 线性定量指纹法评价三黄片紫外指纹图谱整体质量由表3可知，8个质量等级都分配给了所有样品，可见来自19个厂家的30批样品质量差异显著，例如S23为1级属最优产品，相反，S8、S17、S18、S28和S30均为8级属最次产品。所有样品SUV≥0.90，46.3%≤MUV≤253.8%，说明30批样品紫外指纹数量和分布比例较为相似，但整体含量存在明显差别。其中11批产品质量等级＞5级，归其原因主要为定量相似度MUV值的显著差异，如S8、S12、S18、S20、S28和S30因MUV值过高（145%～253%）致使质量等级≥6级；S17、S21、S22、S25和S27因MUV值过低（46%～67%）导致质量等级≥6级。另外，来自同一生产厂家的药品质量一致性也略有差别，例如，S1和S2（购自于百善唐威药业有限公司）拥有相同或相似的质量等级，分别为2级和3级；而S25、S26和S27（购自于亚宝药业）却拥有不同的质量等级，分别为6级、4级和7级。

2.5 三黄片红外指纹图谱的建立和评价

2.5.1 方法学考察精密度试验：取S2样品，按“2.2.2”制备1份，按“2.1.2”检测条件连续进样6次，记录光谱图，导入“中药光谱指纹图谱评价系统3.0”软件，计算SIR≥0.995且RSD为0.13%，表明精密度良好。

稳定性试验：取S2样品，按“2.2.2”制备1份，分别在样品制备后0、1、2、3、4和6 h，按“2.1.2”检测条件进样测定，记录光谱图，导入软件，计算SIR≥0.990且RSD为0.26%，表明样品在6 h内稳定性良好。

重复性试验：取S2样品，按“2.2.2”平行制备6份，按“2.1.2”检测条件进样测定，记录光谱图，导入软件，计算SIR≥0.990且RSD为0.58%，表明本方法重复性良好。

2.5.2 红外指纹图谱的建立将30批三黄片样品依次压片检测，记录光谱图，见图1B，3 600～3 000 cm-1大宽峰为黄酮类或酚酸类羟基伸缩振动引起；2 900 cm-1附件的吸收峰为亚甲基反对称伸缩振动引起；1 800～1 500 cm-1的吸收峰为羧酸类或酯类羰基伸缩振动引起；将样品信号导入“中药光谱指纹图谱评价系统3.0”软件，按均值法生成对照指纹图谱并根据线性定量指纹法计算各样品SIR、MIR和αIR值，所得质量结果见表3。

2.5.3 线性定量指纹法评价三黄片红外指纹图谱整体质量由表3可知，样品质量差异较大，2批样品（S17和S28）为1级；5批（S4、S7～S9和S27）为4级；5批（S14、S16、S22和S29、S30）为5级；4批（S10、S20和S23、S24）为6级；3批（S1、S2和S26）为7级；S3为8级；其余10批为3级。所有样品SIR≥0.94，但65.6%≤MIR≤168.8%，说明30批样品红外指纹数量和分布比例较为相似，但指纹整体含量存在明显差别。S1、S2、S3和S26因MIR值过高（＞140%）未达到质量等级≤5为合格样品的要求；而S10、S20、S23和S24则因MIR值过低（＜70%）。

表3 30批三黄片紫外指纹图谱和红外指纹图谱相似度测定结果

2.6 整合两种分析方法评价三黄片的质量为避免单一方法评价的片面性，实现从多维角度、多方位整合评价中药整体质量，根据公式4～6对紫外指纹图谱和红外指纹图谱分析结果进行整合，由表3可知，整合后的各样品等级差异有所缩小，除S8和S18为8级，S22、S27和S28为6级外，其余样品等级均在5级以内且以1级、2级和3级居多。

图1 30批三黄片样品紫外（A）和红外（B）光谱图

图2 不同评价方法得到的样品质量等级

2.7 不同分析方法的评价结果比较图2描绘了三黄片在不同分析方法下的质量等级情况，采用不同检测方法得到的样品等级不同，如S7在紫外指纹图谱、红外指纹图谱和整合法时质量等级分别为5、4和1级，差异较大，更进一步说明任何一种检测方式因检测原理不同都具有单一片面性，不能全面表征样品真实质量，需采用多种分析方法并用、全方位整合的方式才能客观综合地对其进行评价。鉴于同一检测方式的各批样品质量差异主要来源于定量相似度这一现象，对上述不同分析方法得到的定量相似度作图。见图3。

3 讨论

本文采用紫外指纹图谱联合红外指纹图谱共同评价三黄片质量，运用多种分析技术共同监测样品中饱和、不饱和键的化学成分信息，试图揭示各类化学组分的整体含量特征，从多角度展现中药质量全貌，为中药在其复杂组分未完全分离的情况下，提供了一种简捷快速全面客观的定性定量质控研究方法。

图3 不同评价方法得到的样品定量相似度结果

指纹图谱表征中药化学成分整体概况，但无法获取相关药效活性信息，指纹图谱表征的成分是否代表药效活性成分，与药效相关程度如何，样品质量等级差异是否与药效活性成分含量数量有直接相关关系目前尚未阐明，而且未经药效学验证的化学指纹也有可能为无效成分。因此，构建化学组分与生物活性之间关联度的谱效关系模型将在后续的实验研究中开展并进行报导。

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The Integrated Use of Ultraviolet Spectrum Fingerprint Coupled with Infrared Spectrum Fingerprint to Comprehensively Assess the Quality Grades of San-huang Tablets

Wang Yan1,2，Sun Guoxiang2*
（1.College ofPharmacy and Chemistry,DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000,China；2.College ofPharmacy,Shenyang PharmaceuticalUniversity,Shenyang 110016,China）

Objective:To comprehensively evaluate the quality grades of 30 batches of San-huang tablets from diverse commercial brands.Methods:Ultraviolet spectrum fingerprint and infrared spectrum fingerprint were developed for the measurement of Sanhuang tablets.To evaluate the quality of the drug samples,SL,MLandαvalues were computed for each analytical method,and the integrated SL,MLandαvalues were also calculated by taking the average value of the above-established method.Results:Mostofthe samples were qualified（quality grade≤5）after the use of integrated method.Conclusion:Any detection method is single and onesided,and could notoverallcharacterize the tested samples,which reminds us thatitis essentialto adoptmulti-approaches to disclose the quality information oftraditional Chinese medicine and herbalpreparations.The strategy proposed in this study provides a simple, fast,comprehensive and objective approach for the quality control of traditional Chinese medicine and herbal preparations from both the qualitative and quantitative aspects,in the case thatcomplex components are notyetcompletely separated.

San-huang tablets;ultravioletspectrum fingerprint;infrared spectrum fingerprint

O657

A

2096-2266（2017）06-0031-06

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.06.008

（责任编辑李杨）

国家自然科学基金资助项目（81560695）；大理大学博士科研启动基金资助项目（KYBS201512）

2016-10-18

2016-12-01

王燕，高级实验师，博士，主要从事中药质量标准和体内药物分析研究.

*通信作者：孙国祥，教授，博士.