补肾活血颗粒对去卵巢小鼠心脏巨噬细胞M1/M2极化的影响

贾承明+马静+陈昌波+曹亮+李颖琪+吴雷涛

[摘要] 目的 探讨补肾活血颗粒是否能够通过调控巨噬细胞M1/M2极化治疗去卵巢小鼠心脏微血管病变。 方法 按照随机数字表法将30只SPF级8周龄C57BL/6小鼠分为假手术组、模型组和治疗组。制备去卵巢小鼠模型8周后，治疗组给予补肾活血颗粒（含生药6 g/mL），灌胃8周，1次/d；假手术组和模型组给予同体积生理盐水，灌胃8周，1次/d。通过HE染色、免疫荧光染色和实时定量PCR等方法检测补肾活血颗粒对心脏组织结构、超氧阴离子、CD31、CD68和白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-10、血管内皮生长因子（VEGF）的mRNA表达的影响。 结果 与假手术组比较，模型组心脏组织中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA、超氧阴离子、CD68表达明显增加（P < 0.05），CD31、IL-10 mRNA表达明显减少（P < 0.05）。与模型组比较，治疗组小鼠心臟组织中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA、超氧阴离子明显降低（P < 0.05），CD31、IL-10 mRNA表达明显增多（P < 0.05），但两组CD68表达差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 补肾活血颗粒可能通过调控巨噬细胞M1/M2极化治疗去卵巢小鼠心脏微血管病变。

[关键词] 补肾活血颗粒；巨噬细胞极化；心脏微血管病变；去卵巢

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（b）-0029-04

[Abstract] Objective To explore whether Bushen Huoxue Granules could cure cardiac microvascular dysfunction by regulating M1/M2 macrophage polarization in female ovariectomized mice. Methods According to random number table， 30 SPF level and 8 weeks old C57BL/6 mice were divided into sham group， model group and treatment group. Eight weeks after ovariectomy， treatment group was given Bushen Huoxue Granules （containing crude drugs 6 g/mL） by gavage， once a day， for eight weeks. Sham group and model group were given the same volume of physiological saline. HE staining， immunofluorescence staining and real-time quantitative PCR were used to detect the influences of Bushen Huoxue Granules on organization structures of heart tissue， the ultra oxygen anion， platelets endothelial cell adhesion molecules （CD31）， CD68， and the mRNA expression of interleukin （IL）-1β， tumor necrosis factor （TNF）-α， IL-10 and vascular endothelial growth factor （VEGF）. Results Compared with the sham group， the expression of IL-1β mRNA， TNF-α mRNA， ultra oxygen anion， CD68 cells in model group were increased （P < 0.05）， while the expression of CD31， IL-10 mRNA were decreased （P < 0.05）. Compared with the model group， the expression of IL-1β mRNA， TNF-α mRNA， ultra oxygen anion of heart tissue in the treatment group were decreased （P < 0.05）， while the expression of CD31 and IL-10 mRNA were increased （P < 0.05）. No significant difference was found with the expression of CD68 between the model group and treatment group （P > 0.05）. Conclusion Bushen Huoxue Granules may cure cardiac microvascular dysfunction by regulating M1/M2 macrophage polarization in ovariectomized mice.

[Key words] Bushen Huoxue Granules； Macrophage polarization； Cardiac microvascular dysfunction； Ovariectomized

研究证实，心脏微血管病变是女性绝经后心血管疾病的危险因素[1-3]。炎性反应始终贯穿于心脏微血管病变中[4-5]，而巨噬细胞表型M1/M2在炎性反应中发挥重要作用[6]。前期研究证实[7-8]，补肾活血颗粒不仅能治疗微血管性心绞痛，还能抑制炎性反应，但其能否调控心脏巨噬细胞M1/M2极化影响炎性反应，尚无报道。因此，本研究拟通过观察巨噬细胞M1/M2极化与心脏微血管损伤的关系，探讨补肾活血颗粒对心脏微血管的保护作用机制，为临床应用提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

将由第四军医大学实验动物中心提供的30只SPF级、8周龄、体重19～21 g、雌性C57BL/6小鼠适应性喂养1周，12 h昼夜交替，室温18～22℃，湿度50%～60%，食物和水自由摄取。动物合格证号SCXK（军）-2007-007。动物使用过程符合《陕西省实验动物管理办法》。

1.2 实验药品

补肾活血颗粒（仙茅、仙灵脾、知母、黄柏、当归、葛根、醋香附、远志）（西京医院中药房提供，批号：504 251L），戊巴比妥钠（北京普博斯生物），CD31兔抗大鼠单克隆抗体（批号：SAB5600061）、CD68兔抗小鼠多克隆抗体（批号：SAB1401062）、FITC-/Rho交联二抗（批号：FITC1）（美国，SIGMA公司），氢化乙啡啶（DHE）-超氧阴离子荧光探针（碧云天生物技术研究所，批号：S0036），TRIzol提取液（批号：15596-018）、M-MLV反转录酶（批号：28025-014）（美国，Invitrogen公司），SYBR green qRT-PCR检测试剂盒（日本，TAKARA公司，批号：13417000），引物合成（上海桑尼生物科技有限公司）。

1.3 实验仪器

光学显微镜（型号：CX41-12C02），倒置荧光显微镜（型号：IX73）（日本，Olympus公司），激光共聚焦显微镜（日本，Nikon公司，型号：Nikon A1 R），NIS-Viewer图像处理软件系统（日本，Nikon公司），Bio-RadCFX96型实时定量PCR仪（美国，Bio-Rad公司），台式低温高速离心机（德国，Eppendorf公司，型号：5424R）。

1.4 实验分组

采用随机数字表法将30只小鼠分为三组，分别为假手术组、模型组和治疗组。参考文献[9]，治疗组小鼠灌服中药颗粒剂水溶液5 mL/（kg·d）（含生药6 g/mL），造模后第9周开始灌胃，连续8周，1次/d；假手术组和模型组小鼠灌服同体积生理盐水，造模后第9周开始灌胃，连续8周，1次/d。

1.5 小鼠去卵巢模型制作

1%戊巴比妥钠（30 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠后，俯卧位固定，腰椎后侧正中切口约1 cm，切除双侧卵巢后将输卵管、血管等结扎，缝合皮肤并消毒[10]。治疗组和假手术组操作同上，但假手术组不切除卵巢，仅切除少许卵巢周围的脂肪组织。术后第8天开始，采用阴道涂片法[11]，观察模型组和治疗组小鼠动情周期，连续6 d，1次/d，若没有出现规则的动情周期，则表明造模成功，造模失败的小鼠弃去。

1.6 HE染色

心脏组织经9%福尔马林固定液过夜脱水后，石蜡包埋切片，切片组织经过二甲苯和梯度酒精脱水脱蜡，苏木精染色3～5 min，1%盐酸乙醇分化30 s，1%氨水返蓝10 s，1%伊红染色1 min，酒精脱水，晾干后封片。

1.7 荧光探针标记超氧阴离子

参考文献[12]，取适量浓度为2 mmol/L的DHE覆盖心脏组织，37℃避光孵育30 min后封片。

1.8 免疫荧光染色测定CD31和CD68的表达

取适量山羊血清将组织切片进行封闭，滴加一抗（1∶250）4℃孵育过夜，PBS洗3次后滴加二抗（1∶200），37℃孵育1 h，PBS洗3次后封片。

1.9 实时荧光定量PCR

取新鲜心脏组织采用TRIzolR试剂盒提取总RNA，定量后使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，将cDNA用荧光定量检测试剂盒（SYBR Green）在Bio-rad CFX96实时荧光定量PCR仪上进行检测相关mRNA的表达。反应条件：94℃变性2 min，94℃ 20 s，60℃ 34 s，44个循环；最后加溶解曲线检测。实时定量PCR的引物序列为：白细胞介素（IL）-1β（上游引物：5′-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3′，下游引物：5′-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3′）；肿瘤坏死因子（TNF）-α（上游引物：5'-CGCGGATCCATGAGCACTGAAAGCATG-3′，下游引物：5'-CCGCTCGAGTCACA-GGGCAATGATCCCAAAG-3′）；IL-10（上游引物：5′-TTTAGGCGAGAAGCTGAAGG-3′，下游引物：5′-TCT-TCACAGGGCAGGAATCT-3′）；血管内皮生长因子（VEGF）（上游引物：5′-AGGCAGACTATTCAGCGGACTC-3′，下游引物：5′-CTCAAAACCGTTGGCACGA-3′）；β-actin（上游引物：5′-CTGTATTCCCCTCCATCGTG-3′，下游引物：5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′）。

1.10 統计学方法

应用SPSS 23.0软件进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间的比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况

与假手术组比较，去卵巢小鼠阴道脱落细胞涂片见大量白细胞和少量角化上皮细胞，无周期性阴道细胞变化。20只去卵巢小鼠中，16只小鼠心肌组织变性，炎症细胞不同程度浸润，4只心肌结构较为完整，故该模型造模成功率为80%。

2.2 对心脏组织形态结构的影响

假手术组心肌结构完整，排列整齐，胞浆丰富；模型组心肌细胞肿胀，横纹模糊，心肌组织出现变性，炎症细胞浸润增多，心肌间质充血；治疗组心肌组织结构较为完整，炎症细胞浸润较模型组减少。见图1A（封三）。

2.3 对心脏组织超氧阴离子的影响

與假手术组比较，模型组心脏组织超氧阴离子平均荧光强度升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，治疗组超氧阴离子平均荧光强度降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1B（封三）。

2.4 对心脏组织CD31表达的影响

与假手术组比较，模型组心脏组织CD31平均荧光强度降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型组比较，治疗组CD31平均荧光强度升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1C（封三）。

2.5 对心脏组织CD68表达的影响

与假手术组比较，模型组心脏组织单位面积内CD68表达数增多，差异有统计学意义（P < 0.05）。模型组和治疗组心脏组织单位面积内CD68表达数比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1D（封三）。

2.6 对去卵巢小鼠心脏IL-1β、TNF-α、IL-10、VEGF mRNA表达的影响

与假手术组比较，模型组心脏IL-1β、TNF-α mRNA表达水平升高（P < 0.05），IL-10、VEGF mRNA表达水平降低（P < 0.05）。与模型组比较，治疗组心脏IL-1β、TNF-α mRNA表达水平降低（P < 0.05），IL-10、VEGF mRNA表达水平升高（P < 0.05）。见图2。

3 讨论

绝经后女性心脏微血管病变发病率高，严重影响生活质量，受到心血管领域学者广泛重视。该病属中医“胸痹”“心痛”范畴，肾虚血瘀是其主要病理机制之一。前期研究证实[8-9]，补肾活血颗粒对去卵巢大鼠心肌微血管的保护作用与阻断NF-κBp50（IκBα）-IL-1β通路有关，且该复方浓度为3 g/mL时效果最佳。而IL-1β是M1型巨噬细胞的标志炎症因子，故推测巨噬细胞表型与去卵巢心脏微血管损伤有关，同时为了探究补肾活血颗粒的保护作用，所以采用前期研究中效果最佳的浓度进行实验。

研究表明[13]，心脏微血管病变中伴有炎症细胞浸润，促炎因子增多，超氧阴离子自由基积聚导致血管内皮细胞受损。炎性反应中的巨噬细胞主要有M1和M2两种表型，且M1可向M2极化[14]。M1促进炎性反应，分泌炎性因子，如IL-1β和TNF-α，增强炎性反应，导致组织损伤；M2抑制炎性反应，高表达IL-10，促进组织修复和血管生成[15-17]。

本研究发现，去卵巢模型心脏组织变性，单位面积内的炎症细胞、CD68细胞（M1/M2型巨噬细胞的共同标志[18]）及IL-1β、TNF-α mRNA表达水平增多，超氧阴离子升高，表明去卵巢后心脏组织巨噬细胞浸润增多，促炎因子分泌增多，炎性反应加重，致使心脏超氧阴离子积聚，同时发现VEGF和CD31表达下降，这一结果与以往研究[19]结果相同，即在炎性反应中超氧阴离子积聚与心脏微血管受损密切相关[20]，提示小鼠去卵巢后会引起心脏微血管炎性损伤。同时，与模型组比较，治疗组心脏组织结构较为完整，单位面积内炎症细胞减少，VEGF和CD31表达升高，M2标志因子IL-10表达增多，M1标志因子IL-1β、TNF-α表达减少，且超氧阴离子降低，表明治疗组心脏组织炎症减弱，微血管损伤减轻。然而，治疗组心脏单位面积内巨噬细胞的数量没有明显变化。以上结果表明，补肾活血颗粒改善心脏微血管损伤，与巨噬细胞的数量无关，而是使其极性发生了转化，即M1向M2转化，达到抑制微血管炎性反应和促进心脏微血管修复的双重作用。

总之，补肾活血颗粒治疗去卵巢小鼠心脏微血管病变的机制可能与调控巨噬细胞M1/M2极化相关，即该复方干预后，M1/M2极化发生改变，炎性反应减弱，损伤组织得到修复，最终达到治疗的目的。但是，由于本研究仅涉及到动物水平，初步探讨了补肾活血颗粒对巨噬细胞极化的影响，其相关分子机制研究有待进一步探索。

本研究在第四军医大学生物化学与分子生物学教研室完成，特别感谢。

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（收稿日期：2017-01-23 本文編辑：张瑜杰）