乳腺癌患者PTEN、p—AKT蛋白表达情况变化及相关性

梁法清+何阳君+杜正贵

[摘要] 目的 探討乳腺癌患者蛋白酪氨酸酶基因（PTEN）、磷酸化蛋白激酶（p-AKT）蛋白表达及意义。 方法 选取2014年2月～2016年7月华西医院收集的乳腺癌组织标本91例，同时选取距肿瘤边缘大于1 cm正常乳腺组织作为对照，采用免疫组化法检测PTEN和p-AKT蛋白表达。 结果 乳腺癌组织PTEN表达阳性率明显低于癌旁组织（P < 0.05），而p-AKT蛋白表达阳性明显高于癌旁组织（P < 0.05）；腋窝淋巴结转移患者PTEN蛋白表达阳性率明显低于无腋窝淋巴结转移患者（P < 0.05），而p-AKT蛋白表达阳性明显高于无腋窝淋巴结转移患者（P < 0.05）。PTEN蛋白和p-AKT蛋白表达与患者组织分级有关（P < 0.05）；p-AKT蛋白表达与患者TNM分期有关（P < 0.05）；PTEN蛋白和p-AKT蛋白表达与乳腺癌患者年龄、绝经情况、肿瘤大小、雌激素受体和孕激素受体无相关性（P > 0.05）；乳腺癌患者PTEN蛋白和p-AKT蛋白表达呈负相关性（r=-0.337，P < 0.05）。 结论 乳腺癌组织PTEN蛋白表达降低，p-AKT蛋白表达升高，且PTEN蛋白和p-AKT蛋白表达呈负相关，可能在乳腺癌发生、发展中有重要作用。

[关键词] 乳腺癌；蛋白酪氨酸酶基因；磷酸化蛋白激酶；免疫组化法

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（b）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of protein tyrosinase gene （PTEN） and phosphorylated protein kinase （p-AKT） in patients with breast cancer. Methods 91 cases of breast cancer tissues in West China Hospital from February 2014 to July 2016 were selected， and normal breast tissues from the edge of tumor tissues 1 cm were selected as control group， immunohistochemical method was used to detect the expression of PTEN and p-AKT protein. Results The positive rate of PTEN expression in breast cancer tissues was significantly lower than that in adjacent tissues （P < 0.05）， but the p-AKT protein expression was higher than the adjacent tissue （P < 0.05）. The PTEN positive expression rate in patients with axillary lymph node metastasis was significantly lower than that in patients without axillary lymph node metastasis （P < 0.05）， while the positive expression of p-AKT protein was significantly higher than that without axillary lymph node metastases （P < 0.05）. The expression of PTEN protein and p-AKT protein was related to the histological grade （P < 0.05）， the expression of p-AKT protein was related to TNM stage （P < 0.05）， the expression of PTEN protein and p-AKT protein were not correlated with age， menopausal status， tumor size， estrogen receptor and progesterone receptor in patients with breast cancer （P > 0.05）. There was a negative correlation between the expression of PTEN protein and p-AKT protein in breast cancer （r=-0.337， P < 0.05）. Conclusion The expression of PTEN protein is decreased in breast cancer， the expression of p-AKT protein is increased， and the expression of PTEN protein and p-AKT protein are negatively correlated， which may play an important role in the development of breast cancer.

[Key words] Breast cancer； Protein tyrosinase gene； Phosphorylated protein kinase； Immunohistochemistry

乳腺癌是临床上发病率位居女性前三位的恶性肿瘤，相关研究显示乳腺癌的发病率可达0.006%以上，且近年来呈现明显的上升趋势[1]。临床上乳腺癌患者容易早期发生淋巴结或者远处转移，临床预后不佳。

肿瘤相关信号通路的激活或者调控机制的异常，可以通过影响到癌细胞的增殖、分化及凋亡等病理生理过程，进而促进乳腺癌的发生、发展。而通过对于相关生物学机制的研究，可以揭示乳腺癌的发病机制，并可以为乳腺癌患者的临床预后评估等提供潜在的参考指标。Ras/PI3K/Akt信号通路的激活，在乳腺癌的发生过程中发挥了重要的调控作用，而蛋白酪氨酸酶基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）蛋白可以通过稳定AKT的表达，进而调控信号通路的激活，稳定细胞增殖或者细胞分化等过程，从而起到平衡的作用[2-4]。本研究选取2014年2月～2016年7月华西医院（以下简称“我院”）收集的乳腺癌组织标本91例，探讨了PTEN、磷酸化蛋白激酶（phosphorylated protein kinase，p-AKT）的表达，并揭示了其与乳腺癌患者临床病理特征间的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年2月～2016年7月我院收集的乳腺癌组织标本91例，同时选取距肿瘤边缘大于1 cm正常乳腺组织作为对照；所有组织均来自女性患者，年龄为30～65岁，中位年龄50岁。纳入标准：①均接受乳腺癌根治术或改良根治术，术后均经病理证实；②术前未接受放化疗等治疗；③患者及家属知情同意并签署同意书。排除标准：①临床病理资料欠缺；②术前接受放化疗等治疗；③对照组标本经病理学检查被肿瘤累及。

1.2 检测方法

采用石蜡切片脱蜡至水，切片厚度3 mm，3%H2O2室温孵育5 min，采用去离子水冲洗3次，每次3 min，采用浓度为10%牛奶蛋白（1 g蛋白加入100 mL纯水）封闭，室温孵育5 min，加入PTEN和p-AKT抗体（鼠来源，南京碧云天生物科技有限公司），37℃ 孵育2 h，PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min，滴加HRP标记的二抗（兔来源，购自罗氏检测公司），37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，加入NBT/BCIP色剂显色5 min，复染，脱水，透明，封片，镜下观察。OLIPICS电子显微镜购自上海精密仪器有限公司，配套试剂购自南京泰康生物科技有限公司。PTEN蛋白主要表达于细胞质和细胞膜，p-AKT蛋白主要表达于细胞质和细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒，随机选取10个高倍镜计数1000个细胞，阳性细胞比例≥20%为阳性。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；等级资料比较采用秩和检验；相关性采用Spearman等级相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTEN和p-AKT蛋白在乳腺癌和癌旁组织中的表达

乳腺癌组织PTEN表达阳性率明显低于癌旁组织（P < 0.05），而p-AKT蛋白表达阳性明显高于癌旁组织（P < 0.05）。见表1、图1（封三）。

2.2 PTEN和p-AKT蛋白表达与病理特征关系

腋窝淋巴结转移患者PTEN蛋白表達阳性率明显低于无腋窝淋巴结转移患者（P < 0.05），而p-AKT蛋白表达阳性明显高于无腋窝淋巴结转移患者（P < 0.05）；PTEN蛋白和p-AKT蛋白表达与患者组织分级有关（P < 0.05）；p-AKT蛋白表达与患者TNM分期有关（P < 0.05）；PTEN蛋白和p-AKT蛋白表达与乳腺癌患者年龄、绝经情况、肿瘤大小、雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）无相关性（P > 0.05）。见表2。

2.3 相关性分析

乳腺癌患者PTEN蛋白和p-AKT蛋白表达呈负相关性（r=-0.337，P < 0.05），见表3。

3 讨论

癌基因的激活、癌相关信号通路相关生物蛋白分子的上调及内分泌激素的紊乱等，均可以促进乳腺癌的发生发展，特别是在年龄大于35岁的育龄期女性人群中，乳腺癌的发病率更高[5-7]。一项临床回顾性分析研究显示，乳腺癌的病死率可达35%以上，五年生存率不足30%，中位生存时间不足24个月[8]。而通过对于乳腺癌发病过程中相关肿瘤信号通路分子的研究，可以为早期临床干预、远期临床预后评估及分子靶向治疗等提供依据，进而改善患者的远期生存预后。

Ras/PI3K/Akt信号通路是调控细胞增殖、细胞周期及细胞早期侵袭的重要信息传递通路，Ras/PI3K/Akt信号通路的激活可以通过促进细胞快速跨越G0期，增加G2/G1期细胞比例，进而促进癌细胞的分化增殖活性[9-10]；Ras/PI3K/Akt下游信号通路分子p-AKT的表达，可以在其羧基末端的多重巯基结构的三级空间旋转、糖蛋白配体的结合及磷酸化修饰等方面发挥作用，从而导致癌细胞对于临近新生血管或者组织的浸润[11-12]。Ras/PI3K/Akt信号通路及p-AKT蛋白在卵巢癌、甲状腺癌及肝癌等恶性肿瘤中异常表达，且p-AKT蛋白表达越高，患者的临床分期越晚，远期生存指标如中位生存时间越短[13-14]，虽然也有相关研究探讨了p-AKT在乳腺癌组织中的异常表达，但相关研究仅仅限于流行病学研究，且缺乏对于P-TEN及p-AKT的相关关系的探讨。

本研究发现，乳腺癌组织中的PTEN和p-AKT蛋白的表达与癌旁组织具有明显的差异，PTEN的表达明显下降，而p-AKT的表达明显上升，高于癌旁组织，差异有统计学意义（P < 0.05），提示二者可能参与到了乳腺癌的发生、发展过程中。PTEN的表达缺失失去了其对于p-AKT的表达调控作用，进而导致乳腺癌细胞侵袭能力增强，促进其对于乳腺导管、小叶等组织的浸润。有研究通过免疫组化分析乳腺癌组织资料，发现PTEN的表达阳性率不足35%，且p-AKT的表达可较普通对照组织上升25%以上，这与本研究的结论较为一致[15]。PTEN蛋白和p-AKT蛋白表达与肿瘤大小、ER和PR无相关性，提示性激素受体敏感性或者受体密度等的改变，并不会影响到相关肿瘤生物学分子的表达，同时也表明Ras/PI3K/Akt的表达与性激素受体或者信号通路的相关性不强。在发生了淋巴结转移的患者中，P-TEN的表达显著下降，而p-AKT的表达明显上升，P-TEN的表达阳性率的缺失导致癌细胞其对于淋巴结内皮细胞的侵袭能力增强，增强了其对于腋窝淋巴结或者锁骨下淋巴结等的转移风险，而p-AKT的表达上升，可以在诱导内皮生长因子的上调或者激活的同时，促进了癌细胞对于淋巴结间质成分组织细胞的结合能力，进而导致乳腺癌患者淋巴结的跳跃式传递风险的增加[16-18]。PTEN蛋白和p-AKT蛋白表达与患者组织分级有关，从机制上考虑可能与以下原因有关：①PTEN蛋白和p-AKT蛋白表达的改变，可以影响到Ras/PI3K/Akt信号通路下游核转录基因的表达[19-20]，进而通过影响到效应蛋白HCY的表达异常，增强了癌细胞的变形及侵袭能力，促进了病灶组织对于临近正常组织或者远处器官如肺部或者脑组织的转移能力；②PTEN蛋白和p-AKT蛋白的表达异常，加剧了肿瘤细胞对于基底膜等屏障的穿透能力，促进了肿瘤细胞通过导管或者淋巴管转移。但本研究并未发现P-TEN的表达与TNM分期的关系，考虑到临床样本量的选择偏移、病情严重程度的不同等，可能影响到了结论的代表性。

综上所述，乳腺癌组织PTEN蛋白表达降低，p-AKT蛋白表达升高，且PTEN蛋白和p-AKT蛋白表达呈负相关，可能在乳腺癌发生、发展中有重要作用。

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（收稿日期：2017-02-09 本文编辑：李岳泽）