自噬相关蛋白在肾透明细胞癌与癌旁组织中表达状况对比

谢清灵+徐桂+彬尧凯+何永忠

【摘要】 目的：對比自噬相关蛋白在肾透明细胞癌与癌旁组织中表达状况。方法：选取2016年3月20日-2017年3月20日本院收治的50例实施根治性肾切除术患者为研究对象，手术过程中切取患者两部分组织，一部分为癌变组织，一部分为癌旁组织（即正常组织），且将其制作为标本，对其进行免疫组化染色测定、组织芯片制作、IMAGE PRO PLUS6.0软件测量，并对自噬相关蛋白表达水平变化进行相关性分析。结果：从免疫组化染色评分角度分析，肿瘤组织的ATG7（1.36±0.58）、LC3（2.05±0.36）、Beclin 1（0.55±0.32）水平均低于正常组织[（2.63±0.78）、（3.48±0.45）、（2.47±0.69）]，而ULK1（3.69±0.45）、P62（3.54±0.37）、P-mTOR（2.99±0.85）均高于正常组织[（2.69±0.35）、（2.31±0.45）、（2.05±0.36）]，差异均有统计学意义（P<0.05），肿瘤组织和正常组织的ATG5值分别为（2.67±0.54）、（2.45±0.66），差异无统计学意义（P>0.05）；从IMAGE PRO PLUS6.0软件测量结果角度分析，肿瘤组织的ATG7（0.029±0.010）、LC3（0.021±0.010）、Beclin 1（0.003±0.006）、P-mTOR（0.038±0.019）均低于正常组织[（0.034±0.020）、（0.043±0.015）、（0.023±0.016）、（0.031±0.013）]，而P62（0.029±0.018）、ULK1（0.032±0.014）均高于正常组织（0.020±0.009、0.025±0.010），差异均有统计学意义（P<0.05），肿瘤组织和正常组织的ATG5值分别为（0.034±0.020）、（0.043±0.010），差异无统计学意义（P>0.05）；根据自噬相关蛋白表达水平变化的相关性分析结果，P-mTOR、LC3、P62的表达与ATG7的表达水平变化有关，Beclin 1的表达与其他蛋白不相关，ULK1的表达变化与ATG7和P62相关。结论：自噬的表达水平在肾透明细胞癌中表现为下调状态，而其下调可受到ATG7、LC3、Beclin 1、ULK1、P62、P-mTOR等多种自噬相关蛋白协同影响。

【关键词】 自噬相关蛋白； 肾透明细胞癌； 癌旁组织； 对比

Expression of Autophagy Related Proteins in Renal Clear Cell Carcinoma and Adjacent Tissues/XIE Qing-ling，XU Gui-bin，YAO Kai，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（17）：001-004

【Abstract】 Objective：To explore the expression of autophagy related protein in renal cell carcinoma and adjacent tissues.Method：From March 2016 to March 2017，50 cases with radical nephrectomy were selected as the experimental object.During the operation，part of cancerous tissue and adjacent tissues（normal tissue） of patients were cut out to make specimens which were processed by immunohistochemical staining，made to tissue microarray and measured by IMAGE PRO PLUS6.0 software.Correlation analysis of autophagy related protein expression were conducted.Result：According to the immunohistochemical staining score，ATG7（1.36±0.58），LC3（2.05±0.36），Beclin 1（0.55±0.32） of cancerous tissue were lower than ATG7（2.63±0.78），LC3（3.48±0.45），Beclin 1（2.47±0.69） of adjacent tissues，ULK1 （3.69±0.45），P62（3.54±0.37），P-mTOR（2.99±0.85） of cancerous tissue were higher than ULK1（2.69±0.35），P62（2.31±0.45），P-mTOR（2.05±0.36） of adjacent tissues，the differences had statistical significance（P<0.05），ATG5 of tumor tissues and normal tissues were （2.67±0.54），（2.45±0.66），the difference had no statistical significance（P>0.05）.By the measurement results of IMAGE PRO PLUS6.0 software，ATG7（0.029±0.010），LC3（0.021±0.010），Beclin 1（0.003±0.006），P-mTOR（0.038±0.019） of cancerous tissue were lower than ATG7（0.034±0.020），LC3（0.043±0.015），Beclin 1（0.023±0.016），P-mTOR（0.031±0.013） of adjacent tissues，and P62（0.029±0.018），ULK1（0.032±0.014） of cancerous tissue were higher than P62（0.020±0.009），ULK1（0.025±0.010） of adjacent tissues，the differences had statistical significance（P<0.05），ATG5 of tumor tissue and normal tissue were （0.034±0.020），（0.043±0.010），the difference had no statistical significance（P>0.05）.From the perspective of correlation analysis，the expression of P-mTOR，LC3，P62 was related to the expression level of ATG7.The expression of Beclin 1 was not related to other proteins.The expression of ULK1 was correlated with ATG7 and P62.Conclusion：The expression level of autophagy is down regulated in renal clear cell carcinoma，and its down-regulation may be affected by ATG7，LC3，Beclin 1，ULK1，P62，P-mTOR and other autophagy related proteins.

【Key words】 Autophagy related protein； Renal clear cell carcinoma； Para-carcinoma tissue； Contrast

First-authors address：The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510700，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.17.001

肾细胞癌属于恶性肿瘤之一，在泌尿科较为常见。自噬主要是指细胞通过双层膜或单层膜包裹等待降解物形成自噬体，随后形成自噬溶酶体，并进行多种酶的降解和消化，从而实现稳定细胞内微环境和实现细胞内成分的更新，其主要标志物为微管相关蛋白1轻链3，常参与自噬体的形成[1]。近年来，肿瘤和自噬的关系广泛受到专家重视，且有研究表明，自噬在肿瘤形成中起到重要作用，且部分学者认为BECLIML在自噬中属于抑癌基因[2]。而本文旨在探索自噬相关蛋白在肾透明细胞癌与癌旁组织中表达的临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本次的探索对象为50例实施根治性肾切除术患者，所有患者均在2016年3月

20日-2017年3月20日期间收治。在患者手术中选取一块正常肾组织和一块肾癌组织，并将其制作成标本，进行免疫组化染色。其中癌旁组织设定为正常对照，所有患者年龄24～58岁，平均（38.47±3.47）岁，男35例，女15例；TNM分期：Ⅳ期5例，Ⅲ期16例，Ⅱ期14例，I期15例；FUHRMAN 分级：低分化18例，中分化20例，高分化12例。纳入标准：（1）均签署书面同意书；（2）癌旁组织距癌组织边缘>2 cm；（3）术前未进行过免疫、化疗、放疗；（4）经病理检查，患者均确诊为肾透明细胞癌。排除标准：（1）心功能不全患者；（2）依从性较差患者；（3）手术禁忌证患者；（4）先天性语言功能障碍或听力功能障碍患者；（5）危重症患者；（6）资料不全患者。

1.2 方法 （1）生化试剂：由美国ABCAM公司提供一抗，包括ATG7（ab52472）、ATG5（ab64227）、ULK1（ab65056）、Beclin 1（ab51031）、LC3（ab48394）、P62（ab56416）、P-mTOR（ab51044）。其中P62属于自噬特异性底物，P-mTOR的活性负性调节自噬，以上两类蛋白的自噬负和表达相关，而ATG7、ATG5、ULK1、Beclin 1、LC3属于自噬通路蛋白，其表达的高低能够反映出自噬含量。由北京中杉金桥公司提供二抗、DAB、检测试剂盒PV6000，且实施二步法检测。（2）免疫组化染色和组织芯片：采用QUICK RAY组织芯片制备仪（由韩国UNITMA公司提供）制作组织芯片。首先使用梯度乙醇脱蜡水化后，在双氧水（3%）中孵育30 min，且封闭内源性过氧化物酶。二抗室温孵育30 min；一抗在温度为4 ℃环境下过夜，苏木精复染，DAB染色。

1.3 观察指标与评定标准 使用两种方法对结果进行判定：（1）使用IMAGE PRO PLUS6.0软件对组织染色程度进行测量，同时再进行统计学分析；（2）由医生对标本进行染色结果判定，且根据标本染色程度，进行0～4分的标准打分，判定依据为颜色深浅。对比癌组织和正常组织的免疫组化染色评分以及IMAGE PRO PLUS6.0软件测量结果。分析自噬相关蛋白表达水平变化的相关性分析P值。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验和相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常组织和癌组织免疫组化染色评分比较 肿瘤组织的ATG7、LC3、Beclin 1水平均低于正常组织，ULK1、P62、P-mTOR均高于正常组织，差异均有统计学意义（P<0.05），而ATG5含量对比，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 正常组织和癌组织免疫组化染色IMAGE PRO PLUS6.0软件测量结果比较 肿瘤组织和正常组织ATG7、LC3、Beclin 1、ULK1、P62、P-mTOR含量对比，差异均有统计学意义（P<0.05），而ATG5含量对比，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.3 自噬相关蛋白表达水平变化相关性分析 Beclin 1

的表达与其他蛋白不相关，ULK1的表达变化与ATG7和P62相关，P-mTOR、LC3、P62的表达与ATG7的表达水平变化有关。

3 讨论

在肿瘤进展、发生过程中，为了维护细胞增殖，需大量的氧气和营养物质。而自噬便属于肿瘤细胞代谢应激和抵抗缺氧的原因，在肿瘤缺乏营养素時，通过增强自噬，无法观察到较高的血管化区域[3]，反而言之，自噬的激活能够产生肿瘤生长必须的底物和能量，其可利于肿瘤细胞的繁殖、生存。同时肿瘤的缺氧化状态，可导致预后较差，且促使血管的凋亡，形成肿瘤组织[4]。肿瘤的中心缺氧，还可促进侵袭细胞存活，诱导自噬。常规情况下，在BH3区域中，BCL-2和BCL-XL形成复合物，当机体处于缺氧状态，可促使Beclin 1转化为BNIP3，从而释放Beclin 1诱导自噬激活，克服缺氧[5]。

自噬能够维持基因稳定性，给予细胞提供额外的ATP，及时清除受损细胞和回收失活蛋白[6]。当机体代谢压力达到一定程度时，可过度激活自噬，从而促使细胞凋亡、死亡，此点能够证实，对于肿瘤细胞而言，自噬具有较为重要的意义，大部分肿瘤细胞均存在凋亡障碍，由此说明，下调的自噬能够营造良好的肿瘤生长环境，且本次研究中，也证实了自噬特异性底物P62的积累，能够促进肿瘤的生长[7]。同时本次研究还可发现，肾细胞中较低的自噬相关蛋白的表达和较少的自噬数量，能够表明自噬在肾透明细胞癌中的发展、发生意义，提示自噬水平在肿瘤组织中下调[8]。

目前临床上，对于自噬的调控机制尚未阐述清楚，部分学者认为调节自噬的阀门为mTOP复合物活性[9]。Beclin 1被临床学者认为其是自噬体起始的阶段成分之一，属于一种肿瘤抑制因子，有研究表明，自噬体的形成是由于Beclin 1的严重缺乏。本次研究中发现，Beclin 1和mTOP在肿瘤组织表达中均存在改变现象，其提示着自噬水平下调[10]。而本次研究也发现ATG7和LC3也发生一定意义的改变，其主要提示着机体存在潜在的调控位点[11]。无论是遗传性肾癌还是散发性肾癌，VHL（VON HIPPEL-LINDAU）基因突变起到较为重要作用，VHL基因突变是导致缺氧诱导因子的聚集，而mTOR通路上调的主要原因为缺氧诱导因子聚集，因此肾癌自噬调低的主要原因为VHL基因突变[12]。

自噬在肿瘤治疗中存在较多争议，有研究报道，自噬通过基因敲除和药物抑制，能够改善化疗药物耐受性，助于疾病的恢复，在机体内存在长期影响性，但此项结果有待进一步考察[13]。近年来，临床发现多种mTOR抑制剂已开始广泛应用于临床，且常用于治疗晚期肾癌患者，其主要疗效为通过调节自噬来达到治疗效果[14]。通过分析多项研究报道，发现目前已有多項化合物已被证实，能够促使肿瘤自噬性细胞的凋亡，包括一种特异性对VHL缺乏肾肿瘤的小分子化合物，其促使自噬性细胞死亡称为潜在治疗方案，但具体疗效，还有待证实[15]。

在肾癌患者中，自噬相关基因的表达与癌症分期、分级有关，主要体现为LC3含量的表达，有研究报道，在卵巢癌患者中，LC3的表达与病理分级和病理类型物统计学意义，其证明在不同肿瘤类型中，自噬的表达存在差异性的[16]。而本次研究中，LC3蛋白表达量与分期、分级存在差异性，从分期角度分析，转移性肾癌患者和进展性肾癌患者比局限性肾癌患者的LC3蛋白更低，其证实了自噬活体的降低与肾透明细胞癌的侵袭、发生、发展起到一定作用性，总而言之，自噬的抑制能够作为进展期肾癌的一个标志物[17-18]。

本次实验主要结合了免疫组织化学技术和组织芯片，从而证实了自噬相关蛋白和肿瘤组织变化有关，其中ATG7、LC3、Beclin 1呈现为下调趋势[19]，P62、P-mTOR在肿瘤组织中呈现为上调，结合电镜，可了解到肿瘤细胞内自噬体数量少于正常组织[20]，而此种下调与多种自噬相关蛋白表达有关，结果提示自噬在肾透明细胞癌中表达水平下调，同时为潜在、新型的治疗方式提供了实验基础[21]。

总而言之，Beclin 1、ULK1、ATG7、P-mTOR、LC3、P62是影响自噬相关蛋白下调的主要原因，而自噬蛋白在肾透明细胞癌中具有重要利用价值，且主要呈现为下调状。

参考文献

[1]朱少群，钟美花.磁共振成像技术在18例臂丛神经损伤诊断中的应用[J].中国民族民间医药，2016，25（4）：115，117.

[2]唐怡.ART1调节饥饿诱导的结肠癌细胞自噬及其对癌细胞增殖凋亡影响的研究[D].重庆：重庆医科大学，2015.

[3]宋孟锜，薛寅凯，孙运秀，等.自噬相关哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、微管相关蛋白1轻链3-β在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义[J].中华实验外科杂志，2014，31（5）：1108-1110.

[4]吴楠，闵鹤鸣，屈惠莹，等.自噬基因pULK、PI3KC3在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究[J].天津医药，2015，56（6）：635-638，706.

[5]赵亚通，刘超，庞志刚，等.叉头转录因子O亚家族1及自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ在肝癌组织的表达及意义[J].中华实验外科杂志，2016，33（2）：492-494.

[6]沈芸，向阳，肖长纪，等.转录因子c-Jun对甲氨蝶呤耐药绒毛膜癌细胞内自噬标志蛋白LC3的调节作用[J].中华妇产科杂志，2014，8（7）：531-535.

[7]郭凯，黄波，王晓东，等.自噬相关蛋白在肺鳞癌和腺癌组织中的表达及相关性研究[J].天津医药，2014，74（6）：536-539.

[8]邵乐宁，杨晓东，邢春根，等.肿瘤相关巨噬细胞自噬状态对人大肠癌细胞凋亡的影响[J].中华实验外科杂志，2014，31（7）：1504-1507.

[9]陈佳，王琪，张玮，等.下调MTRR基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究[J].中华妇产科杂志，2016，51（4）：285-292.

[10]刘永青.自噬在天然小分子化合物促进前列腺癌细胞死亡中的作用及其机制研究[D].济南：山东大学，2015.

[11]许赤，蔡惠宁，李翠平，等.RNA干扰技术下调营养缺乏自噬因子1表达对肝癌细胞侵袭转移能力的影响[J].中华细胞与干细胞杂志（电子版），2016，6（2）：80-85.

[12]斯庆图娜拉.联合自噬抑制剂增加PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235诱导的结肠癌细胞凋亡[J].中国实验诊断学，2015，85（10）：1632-1635.

[13]薛妮娜.新型HSP90抑制剂筛选及抗胰腺癌增殖作用和分子机制研究；SHP90抑制剂诱导胰腺癌细胞IGF-1Rβ自噬性降解的分子机制研究[D].北京：北京协和医学院中国医学科学院，2015.

[14]宋建，梁素美，高俊，等.自噬基因LC3B在肺鳞癌中的表达意义及与窖蛋白-1的关系[J].中华临床医师杂志（电子版），2013，78（22）：10 029-10 034.

[15]马泰.细胞自噬在肝癌细胞内质网应激性死亡中的作用及对药物敏感性的影响[D].合肥：安徽医科大学，2013.

[16]冯仰伟.自噬相关基因Beclin-1、LC3和增殖细胞核抗原Ki-67在子宫内膜腺癌组织中的表达及意义[D].泰山：泰山医学院，2015.

[17]张泽兵，全海英，张桐菲，等.自噬在Tca83细胞中的作用及自噬相关基因的表达[J].中华口腔医学杂志，2012，47（z1）：233-238.

[18]朱兴春，刘青松，杨慧敏，等.末端结合蛋白1（EB1）在宫颈组织中的表达及其对自噬标志蛋白表达的影响[J].复旦学报（医学版），2014，41（5）：641-646.

[19]范大为，刘凯，袁成刚，等.Beclin-1与EZH2在肾透明细胞癌中的表达及其意义[J].新医学，2016，47（5）：329-334.

[20]倪晓辰，赵志红，马永良，等.桧木醇诱导人肾透明细胞癌786-O细胞凋亡及其机制研究[J].中国肿瘤临床，2015，45（1）：43-46.

[21]张琦，Shuhui Si，Sue Schoen，等.自噬对Folliculin基因缺陷的肾癌细胞放疗敏感性的影响[J].泌尿外科杂志（电子版），2015，52（3）：16-22，54.

（收稿日期：2017-04-11） （本文编辑：邓朝阳）