高效毛细管电泳—二极管阵列检测法测定微生物代谢产物中的植物激素含量

马晓颖+杨镇++宋艳雨++祝永刚+杨涛

摘要：建立同时分离测定微生物代谢产物中吲哚乙酸、赤霉素、细胞分裂素、脱离酸的毛细管电泳-二极管阵列检测器新方法。研究检测波长、缓冲体系、缓冲体系的pH值及浓度、分离电压、进样时间等因素。结果表明，在运行缓冲液75 mmol/L硼砂缓冲液（pH值为9.0）、75 mmol/L硼酸缓冲液、检测波长218 nm、分离电压20 kV、温度 25 ℃的条件下，吲哚乙酸、赤霉素、细胞分裂素、脱离酸在0.1～5.0 mg/mL内呈较好的线性关系。测得微生物代谢产物中含有细胞分裂素和脱离酸，利用标准曲线获得回归方程测得含量为60.93、22.62 μg/mL。细胞分裂素和脱落酸迁移时间的相对偏差RSD分别为0.13%、0.126%；迁移峰面积RSD（%）分别为1.01%、1.92%，回收率分别为 90.1%～948%、95.8%～96.2%。因此，该方法适用于微生物代谢产物中植物激素的测定。

关键词：高效毛细管电泳；二极管阵列检测；植物激素；微生物代谢产物

中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0169-03

为了实现农业部在扎实推进的“到2020年化肥使用量零增长行动”和“到2020年农药使用量零增长行动”，重点研发高效缓释肥料、高效低毒低残留农药、生物肥料农药等新型产品是十分必要的，而植物激素是被公认的用量少、效果好的植物生长调节剂。微生物天然代谢产物拥有来源安全、对土地环境友好等特点，在未来具有极大的发展潜力。

传统的生物鉴定法对植物激素的测定难以满足准确定量分析的要求，文献报道的高效液相色谱法等虽可获得较准确的结果，但存在操作繁琐、灵敏度差、费用较高的缺点。毛细管电泳技术（HPCE）源自传统电泳技术，具有微量、准确、成本低、污染少、分析时间快、自动化程度高的优点[1]。二极管阵列检测器可以同时检测在190～300 nm波长下样品的出峰情况，并带有3D效果的检测峰形，可以更加直观地判断样品的真实情况，判断出是否为非正常样品的出峰情况。本研究以微生物代谢产物为测定目标，利用高效毛细管-二极管阵列同时测定其中的4种植物激素，并建立了高效快速的植物激素含量测定方法。该方法简单可靠、重复性好，不仅可用于微生物代谢产物中植物激素含量的测定，对其他样品中的植物激素的定性、定量检测都有一定的参考价值。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

仪器：P/ACE MDQ 毛细管电泳仪 （美国贝克曼公司）；未涂层石英毛细管 （75 μm×57 cm，有效检测长度48 cm）（美国贝克曼公司）；精密pH计（北京泰亚赛福科技发展有限责任公司）；高速臺式冷冻型离心机（德国Sigma公司）；超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；紫外分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]；HZQ-QX 全温振荡器（黑龙江省哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；干热消毒箱（上海精宏实验设备有限公司）；DOA-P504-BN 真空泵（IDEX公司）；ETS-D5 磁力搅拌器、A11 高速粉碎机（德国IKA集团）。CascadaTM实验室超纯水系统（Pall corporation）。

试剂：微生物菌种来源于辽宁省农业科学院微生物工程中心；吲哚乙酸（IAA）标样，赤霉素（GA），细胞分裂素（6BA），脱落酸（ABA）（北京奥博星生物技术有限责任公司）；试验过程用的试剂均为分析纯和色谱纯；试验用水为超纯水。

1.2试验方法

新毛细管用甲醇冲洗3 min，1 mol/L的HCl冲洗2 min，0.1 mol/LNaOH冲洗1 min，去离子水冲洗0.5 min。活化好的毛细管使用前用0.1 mol/L的NaOH、水、电泳缓冲液分别冲洗1、2、3min；每次进样之间，用缓冲液冲洗2 min，冲洗压力为20 psi。所有溶液在进入毛细管前，均用0.22 μm的水系微孔滤膜过滤。

样品处理：将发酵后的微生物用双层纱布过滤，用蒸馏水冲洗3次后60 ℃下烘干，称质量。然后采用高速粉碎机粉碎，用10倍体积乙醇浸提24 h，用磁力搅拌器将其混匀，超声波振荡1 h，真空抽滤，用以上方法再提取2次，收集3次滤液备用。将处理好的微生物代谢产物1 mg/mL用0.22 μm孔径的有机滤膜过滤，收集续滤液加同体积的运行缓冲液作为样品溶液。

对照品的配制：将吲哚乙酸、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸分别配成1 mg/mL的母液，用甲醇溶解。上述溶液均用 0.22 μm 孔径的有机滤膜过滤，超声除气，置于冰箱4 ℃保存。

1.3电泳条件

未涂层石英毛细管（75 μm×57 cm，有效检测长度 48 cm）；运行缓冲液为75 mmol/L硼砂缓冲液（pH值为90）；75 mmol/L硼酸缓冲液；检测波长218 nm；分离电压 20 kV；温度 25 ℃；压力0.5 psi进样10 s，样品运行时间为 20 min，4种植物激素运行时间为15 min。

2结果与分析

2.1高效毛细管电泳-二极管阵列检测法条件的优化

选用pH值为9.0的75 mmol/L硼砂冲液、75 mmol/L硼酸缓冲液作为运行缓冲及分离缓冲。压力0.5 psi进样10 s，并在此条件下进行波长优化及电压优化。为选取适当的检测波长，采用PDA检测器对4种激素标准品溶液在波长为 190～300 nm范围内进行扫描，发现4种植物激素具有不同的最适分离波长，但在218 nm处能够达到同时出峰且分离效果较好，故选取此波长作为检测波长。

在确定进样时间方面，进行5、10、20 s进样时间的测定，结果表明，进样5 s峰形不完整，20 s浓度太高，连峰情况增多，故选用10 s为样品的进样时间。

在优化分离电压时，比较分析15、20、30 kV 3个不同电压下4种植物激素迁移与分离情况。发现在15 kV时，基线不好；30 kV时出峰延迟，峰形拖尾，故最终选择20 kV作为电泳测定的运行电压。

试验常用磷酸盐、硼砂等缓冲体系对4种植物激素的分离进行考察，以选取合适的缓冲体系。通过磷酸盐缓冲液不同的pH值，确定分离样品的最适分离pH值，通过试验比较发现，用pH值为9.0的磷盐溶液分离时，样品的分离效果较好，故选择碱性缓冲液硼砂溶液进一步进行优化。

选择10、20、50、75 mmol/mL硼砂缓冲液对4种植物激素进行分离。结果发现，当硼砂缓冲液浓度达到75 mmol/mL时，样品和对照品的分离效果最佳，分离度和峰形都达到了相对最好的情况，故选择75 mmol/mL及pH值为9.0的硼砂，75 mmol/L硼酸缓冲液缓冲体系作为最终运行缓冲液。

2.2高效毛细管电泳-二极管阵列检测法对微生物代谢产物中4种激素的测定

2.2.1定性测定根据图1、图2可知，微生物代谢产物指纹图谱中含有与细胞分裂素（6-BA）和脱落酸（ABA）保留时间相同的物质，与赤霉素（GA）和吲哚乙酸（IAA）的图谱没有重合峰，说明微生物代谢产物中含有细胞分裂素和脱落酸，不含有吲哚乙酸和赤霉素。

2.2.2定量测定根据定性试验的结果，对细胞分裂素和脱落酸在微生物代谢产物中的含量进行定量计算。

2.2.2.1标准曲线的建立将吲哚乙酸、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸分别配成10 mg/mL的母液，用甲醇溶解。根据毛细管电泳中的定量计算方法，将植物激素标准品配成浓度为01、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL，分别进行进样，见图3（由于5.0 mg/mL浓度进样时第2、3个峰浓度较大出现连峰，因此图谱未放到图中）。

根据毛细管电泳中的定量计算方法，将植物激素标准品配成浓度为0.1、1.0、2.0、5.0 mg/mL，分别进行进样，以浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标建立标准曲线方程（图 4、图5）。

毛细管电泳仪最佳条件下，细胞分裂素电泳峰面积与浓度在0.1～5.0 mg/mL范围内呈现良好的线性关系，回归方程为y=715 236.440 4x-22 680，相关系数r2=0.999 23，最低检测限（LOD）为0.14 μg/mL。脱落酸回归方程为y=391 391.409 4x+21 489，相关系数r2=0.999 02，最低检测限（LOD）为0.28 μg/mL。将目的峰的峰面积带入方程，得细胞分裂素的含量为60.93 μg/mL，脱落酸含量为 22.62 μg/mL。

2.2.2.2重复性和精密性试验取同一浓度的细胞分裂素标准样品和脱落酸标准品连续进样5次。测细胞分裂素迁移时间的相对偏差RSD为0.13%，迁移峰面积RSD为1.01%。脱落酸迁移时间的相对偏差RSD为0.126%，迁移峰面積RSD为1.92%。准确度验证采用回收率法进行试验。量取3份样品，分别加入不同量的标准溶液进行测定，实测添加量与标准添加量之比为回收率。通过试验，测得细胞分裂素的回收率在90.1%～94.8%（表1），脱落酸的回收率为95.8%～96.2%。

3讨论

测定植物激素前该微生物代谢产物进行过玉米种子的催芽，稀释10 000倍的效果显著，而500倍的提取物对玉米生长起到了抑制作用，这与植物激素的作用相一致，利用高效毛细管电泳对其中的植物激素进行测定，测得其含有细胞分裂素和脱落酸。但细胞分裂素和脱落酸在植物体内的作用机理尚不明确，产生的植物促生长是联合作用还是有某一单独成分起作用还有待深入研究。

传统的生物鉴定法对植物激素的测定难以满足准确定量分析的要求，文献报道的高效液相色谱法等虽可获得较准确的结果，但存在操作繁琐、灵敏度差、费用较高的缺点。毛细管电泳技术（HPCE）源自传统电泳技术，具有微量、准确、成本低、污染少、分析时间快、自动化程度高的优点。本研究以人参内生真菌菌丝为测定目标，利用高效毛细管法来测定其中的植物激素，通过不同种、不同pH值缓冲液、不同分离电压及不同进样时间等条件优化后，确定了本试验的电泳条件，在建立分离效果较好的真菌代谢产物的指纹图谱的同时，也将各种激素的出峰时间控制在15 min以内，节省了工作时间和成本，可以实现替代高效液相法测定植物激素，避免有机溶剂对人和环境的伤害，为植物激素的测定方法提供了一定的参考价值。

参考文献：

[1]马晓颖，贾东贝，李冰宇，等. 利用高效毛细管电泳测定真菌代谢产物吲哚乙酸含量[J]. 江苏农业科学，2011，39（3）：439-441.

[2]饶钦雄，童敬，郭平，等. 高效毛细管电泳测定鸡蛋中三聚氰胺[J]. 分析化学，2009，37（9）：1341-1344.

[3]郭芳芳，冯锋，白云峰，等. 高效毛细管电泳-紫外检测法同时检测雪糕中多种添加剂[J]. 食品科学，2015，36（8）：206-210.

[4]李利军，冯军，黄文艺，等. 高效毛细管电泳同时分离测定栀子苷、芍药苷及丹皮酚的研究[J]. 分析试验室，2007，26（5）：38-41.

[5]彭进进，罗泽娇，李龙媛. 高效毛细管电泳-二极管阵列检测法测定土壤中的苯酚[J]. 分析科学学报，2012，28（1）：98-100.

[6]张泽宇，李林志. 高效毛细管电泳法测定地榆中没食子酸的含量[J]. 中国药师，2015，18（7）：1233-1235.

[7]张云伟，万勇平，鄢兵，等. 超高效液相色谱法测定水果中3种外源植物激素[J]. 中国卫生检验杂志，2015，25（14）：2277-2279，2283.

[8]刘宏程，林涛，邵金良，等. 高效液相色谱测定水果中外源植物激素的快速前处理方法研究[J]. 分析科学学报，2014，30（4）：497-500.

[9]牟艳莉，郭德华，丁卓平，等. 高效液相色谱-串联质谱法测定瓜果中11种植物生长调节剂的残留量[J]. 分析化学，2013，41（11）：1640-1646.

[10]钟宁，侯彩云. 高效毛细管电泳测定液态乳中乳糖[J]. 中国乳品工业，2011，39（10）：44-47.