野生花生AdWRKY37基因的克隆及表达分析

王鹏飞++王月华++胡子滢++赵传志++陈万钧++王咏梅

摘要：花生是我国重要的经济作物，野生花生（Arachis duranensis）有着许多栽培种花生尚缺乏的性状，是栽培种花生品种改良不可缺少的优异种质源或基因源。植物中，WRKY基因与抗病密切相关。本试验鉴定并克隆了野生花生AdWRKY37基因，并对其基因及蛋白序列进行了生物信息学分析。结果显示，AdWRKY37含有NBS-LRR结构域；顺式调控元件分析显示，AdWRKY37启动子含有水杨酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸（jasmonic，JA）诱导元件。实时荧光定量PCR结果显示，野生花生AdWRKY37基因在受到青枯病菌液胁迫诱导后表达量升高，且经过水杨酸与茉莉酸处理后表达量也显著上升。以上结果说明野生花生AdWRKY37基因可能与青枯病耐受相关。

关键词：WRKY；野生花生；青枯病；水楊酸；茉莉酸

中图分类号：S565.201文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）06-0001-06

AbstractPeanut （Arachis hypogaea L.） is one of the most important economic crops in China. Wild peanuts have many good traits which are lacking in cultivated peanut varieties. Wild peanuts are indispensable germplasm resources as well as genetic resources for improving cultivated peanut varieties. It has been demonstrated that WRKY family transcription factors are involved in various disease resistance in plant. In our study， AdWRKY37， which belongs to WRKY family， was cloned and identified from wild peanut. Furthermore， bioinformatics approach was performed to analyze its gene and protein sequences. The results showed that AdWRKY37 protein contained NBS-LRR domain. Besides， salicylic acid（SA）- and jasmonic acid （JA）-induced elements were also identified in the promoter sequence of AdWRKY37.The expression analysis using qRT-PCR method revealed that the gene expression amount of AdWRKY37 obviously increased under the induction of Ralstonia solanacearum as well as SA and JA treatments. All the results indicated that AdWRKY37 in wild peanuts might participate in resisting to Ralstonia solanacearum.

KeywordsWRKY； Wild peanut； Ralstonia solanacearum； Salicylic acid； Jasmonic acid

花生是我国重要的经济作物，是榨油、食品加工、化工等领域的重要原料。我国花生不仅种植面积广，产量也久居高位，为经济发展作出巨大贡献。然而很多病害如青枯病、叶斑病、锈病、茎腐病、根腐病等对花生种植业影响巨大并且危害日趋严重，已经成为限制我国花生产业发展的重要因素[2]。与栽培种花生不同，野生花生在长期的自然选择过程中积累了许多优良的抗病性状及抗病基因，抗病能力强。因此，可以对野生种花生进行深入研究，挖掘其优良抗病基因，并通过杂交、转基因等手段改良栽培种的抗病性[2]。

目前已知植物中的抗病基因根据其保守序列不同可被分为5类：NBS-LRR（核苷酸结合位点-亮氨酸重复区蛋白）型、eLRR-TM（胞外亮氨酸重复区-跨膜区域蛋白）型、eLRR-TM-pkinase（胞外富亮氨酸重复区-跨膜区域-激酶）型、STK（丝氨酸/苏氨酸激酶）型和其他型[3，4]。其中，NBS-LRR类是植物体内主要的抗病基因。NBS-LRR基因编码的蛋白为核苷酸结合蛋白与富亮氨酸受体蛋白，这种蛋白目前被证实与植物抗病相关[4]。NBS-LRR蛋白含有一个NBS（核苷酸结合位点）结构域和一个LRR（亮氨酸重复区）结构域[5]。NBS-LRR蛋白家族中，NBS结构域相对保守，而LRR多样性较高，也是识别不同病原体的关键结构，其结构多样性与病原菌的多样性有关[6]。研究发现，NBS-LRR基因按其编码蛋白的结构可分为TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR两类[7]。

水杨酸和茉莉酸是植物中重要的信号分子，与植物响应病原菌入侵和抗病密切相关。水杨酸参与植物对病原菌入侵的响应，进而诱发植物的系统获得性抗病性（SAR）[8，9]。而茉莉酸可参与植物对病原菌与昆虫入侵的响应，进而引发植物的诱导系统性抗病性（ISR）[9，10]。研究表明，当植物遭到病原菌入侵后，体内的水杨酸和茉莉酸等信号分子将引起一系列的信号转导，从而激活抗病相关基因的表达[9，10]。

研究证明，很多WRKY家族基因参与植物的抗病、抗逆等生理活动，对植物体抵抗生物胁迫与非生物胁迫具有重要作用[11]。拟南芥中的RRS1基因即为WRKY家族中的一员，其还含有NBS和LRR结构域，在拟南芥的抗病反应中发挥重要作用[12]。WRKY蛋白含有至少60个氨基酸的高度保守结构域，该家族的每个成员在WRKY结构域的N-端都有一段WRKYGQK基序，因而被称为WRKY蛋白。WRKY蛋白家族是一种转录因子家族，其中每个成员都可与启动子上的W-box顺式调控元件特异结合，影响基因的表达[13]。每个WRKY家族成员都含有一个或两个WRKY结构域，在靠近WRKY结构域的位置含有锌指结构。按含有WRKY结构域的个数和锌指结构，可将WRKY家族分为三大组：第一组含有两个WRKY结构域和C2-H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）锌指结构，第二组含有一个WRKY结构域和C2-H2 （C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）锌指结构，第三组含有一个WRKY结构域和C2-HC（C-X7-C-X23-H-X1-C）锌指结构[14，15]。

野生花生（Arachis duranensis）是栽培种花生的祖先之一。本试验拟从野生花生中克隆出WRKY家族成员AdWRKY37基因，并利用生物信息学方法分析其序列结构特征，并通过荧光定量PCR检测AdWRKY37基因在受到青枯病胁迫、茉莉酸和水杨酸处理后的表达变化情况，以研究其在花生抗病过程中的作用。

1材料与方法

1.1试验材料与试剂

试验材料：野生花生（Arachis duranensis）的带叶片枝条、青枯病原菌。

试剂：pMD18-T载体、DH5α大肠杆菌感受态、水杨酸、茉莉酸，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，Plasmid Mini KitⅠ购自OMEGA BIO-TEK公司，T4 DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶购自Fermentas 公司，TaKaRa反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自罗氏试剂公司，LA Taq DNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2试验方法

1.2.1野生花生处理将野生花生枝条分别插入青枯病菌液、水杨酸（0.1 mmol/L） 以及茉莉酸 （0.1 mmol/L） 溶液中进行处理。分别取青枯病菌液处理6、12、24 h，水杨酸及茉莉酸处理12、24 h的野生花生枝条叶片，液氮速冻，-80°C保存。以不做任何处理的花生叶片为对照。

1.2.2总RNA提取及反转录采用CTAB法提取样品总RNA。在液氮中充分研磨样本，将研好的组织迅速转移至含有700 μL预热（65℃）的CTAB提取液的EP管中，立即剧烈涡旋振荡30 s，混匀；65℃水浴2～5 min，期间剧烈涡旋振荡3～5次，稍微冷却后加入等体积的氯仿/水饱和酚涡旋振荡1 min，混匀，4℃、12 000 r/min离心15 min；转移上清液至一新的EP管中，加入等体积的氯仿涡旋振荡1 min，混匀，4℃、12 000 r/min离心15 min；将上清转移到另一新的EP管中，加入等体积异丙醇，4℃过夜沉淀；4℃、12 000 r/min离心20 min，弃上清。用75%乙醇洗沉淀，晾干，加30～50 μL DEPC-H2O溶解沉淀。利用TaKaRa反转录试剂盒将得到的总RNA反转录为cDNA。

1.2.3AdWRKY37基因cDNA全长序列的克隆从野生花生数据库（https：//peanutbase.org/）中通过比对鉴定得到一个WRKY基因，命名为AdWRKY37。根据该基因序列设计引物：AdWRKY37F：5′-CTTGTTGCTTGGACGTTTCA-3′；AdWRKY37R：5′-GAATCTGGAGGACCGAATTATAGTA-3′。PCR反应体系（40 μL）：2 μL的cDNA模板，5 U/μL Pfu高保真DNA聚合酶0.4 μL，5×Buffer 8 μL， 2.5 mmol/L dNTP 3.2 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 24.4 μL。 PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸3.5 min，33个循环；72℃后延伸7 min；保存温度为4℃。

1.2.4AdWRKY37基因启动子分析根据野生花生A基因组序列，鉴定得出AdWRKY37基因的启动子序列（起始密码子上游2 000 bp），通过在线软件PlantCARE对其启动子顺式元件进行分析。

1.2.5AdWRKY37蛋白分析利用在线软件ExPASy对AdWRKY37基因编码蛋白的理化性质进行分析，SubLoc对其亚细胞定位进行分析，SignalP判断其是否含有信号肽；通过Pfam在线软件对其所含结构域进行预测，SWISS-MODEL对其蛋白三级结构进行预测。

1.2.6系统发育分析利用MEGA 6软件将NCBI中搜索到的水稻、大豆、拟南芥等物种中的WRKY蛋白序列构建进化树。表1显示了各物种WRKY的信息。

1.2.7AdWRKY37基因的表达分析利用qRT-PCR方法检测花生叶片经青枯病胁迫6、12、24 h及水杨酸和茉莉酸处理12、24 h时AdWRKY37基因的表达量。以花生Actin基因为内参，AdWRKY37基因的引物为AdWRKY37qF： 5′-TTATTGCTTCTCCATCTC-3′、 AdWRKY37qR：5′-TTGATTACCGTTAGTTCTT-3′。采用FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）试剂盒，按说明书操作。利用ABI 7500实时定量PCR仪进行反应，两步法反应程序为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火及延伸30 s，40个循环。反应结束后根据CT值用2-△△CT法分析AdWRKY37基因的表达量。

2结果与分析

2.1AdWRKY37基因克隆及启动子分析

从野生花生数据库（https：//peanutbase.org/）中鉴定得到一个WRKY基因（ID：Aradu.HD2AV；基因组位置：chr10：6，533，508-6，537，329 ），经克隆得到长度为3 477 bp的序列，将其命名为AdWRKY37基因。取该基因起始密码子上游2 000 bp的启动子序列，利用在线软件PlantCARE进行分析，结果显示，AdWRKY37基因启动子含茉莉酸、水杨酸、生长素等多种植物激素诱导表达元件，以及胚乳特异性表达、光响应、热响应元件（表2）。

2.2AdWRKY37蛋白的理化性质分析

经在线软件ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）分析，AdWRKY37由1 158个氨基酸构成，分子量为131.79 kD，理论等电点为6.82。在氨基酸组成方面，亮氨酸（Leu）含量最高，占全部氨基酸含量的14.3%，其次含量较多的分别是Ser（9.2%）、Lys（7.2%）、Glu（6.6%）、Ile（6.1%）、Asp（5.9%）。带正电荷的氨基酸残基（Arg+Lys）总数为139，带负电荷的氨基酸残基（Asp + Glu）总数为144。该蛋白亲水氨基酸与疏水氨基酸分布均匀且疏水氨基酸多于亲水氨基酸，氨基酸亲水性平均系数为-0.270（图1）。

由SubLoc亚细胞定位分析，AdWRKY37位于细胞核的预期准确度为74%，可靠性指数RI=2。由SignalP在线软件分析，AdWRKY37不含信号肽。

2.3AdWRKY37蛋白结构分析

Pfam在线软件分析显示，AdWRKY37含有WRKY、NBS、LRR保守结构域，位置分别是3 241—3 411、673—1 356、1 495—2 154 bp。此外，AdWRKY37还含有一个锌指结构C2-H2（C-X4-C-X23-H-X1-H），属于WRKY家族的第二组。利用SWISS-MODEL在线软件，预测了AdWRKY37的三级结构，如图2所示。

2.4进化树分析

从NCBI中收集大豆、水稻、拟南芥等WRKY家族基因，利用MEGA 6软件对这些序列进行进化树的构建，结果显示，AdWRKY37基因与拟南芥AtWRKY52基因亲缘关系较近（图3）。拟南芥AtWRKY52基因又名RRS1，与AdWRKY37类似，其编码蛋白含有NBS、LRR和WRKY结构域。前人研究显示，AtWRKY52基因可以提高拟南芥对青枯病胁迫的耐受，并且受水杨酸诱导表达[12]。

2.5AdWRKY37基因的表达分析

实时定量PCR结果显示，AdWRKY37基因在正常花生叶中是不表达的，受青枯病胁迫6 h后，表达量明显升高，说明AdWRKY37基因受青枯病菌诱导表达。此外，AdWRKY37基因的表达受水杨酸诱导，水杨酸处理后，AdWRKY37基因表达量显著升高，且随着处理时间延长而增加。茉莉酸处理后，AdWRKY37基因表达量也上调（图4）。

3讨论

AdWRKY37是包含NBS-LRR结构域的基因，其氨基酸组成中有大量的亮氨酸。SubLoc亚细胞定位分析显示，AdWRKY37定位于细胞核的预期准确度为74%。AdWRKY37含一个WRKY结构域和锌指结构C2-H2（C-X4-C-X23-H-X1-H），属于WRKY家族的第二组。通过进化树分析可以发现，AdWRKY37基因与拟南芥RRS1有较近的亲缘关系，且两者的蛋白三级结构也非常相近，又同时拥有NBS、LRR和WRKY三个结构域。因此，AdWRKY37基因功能可能与RRS1功能相近。目前的研究显示，拟南芥RRS1基因与抗青枯病相关[12]，因此我们初步判断AdWRKY37基因可能参与野生花生抗青枯病的生物过程。病原菌入侵会激发茉莉酸和水杨酸等激素信号途径，并调控下游抗病基因的表达。启动子分析显示，AdWRKY37基因启动子中含茉莉酸、水杨酸等多种植物激素诱导表达元件，而外源水杨酸和茉莉酸处理可以诱导野生花生AdWRKY37基因的表达，说明该基因可能响应这些激素信号或受这些激素信号途径的影响，推测与野生花生的抗病机制相关。而青枯病菌液对野生花生的直接处理导致AdWRKY37基因表达上调，进一步说明了AdWRKY37基因可能参与野生花生抗青枯病的生物过程。

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