骨疏颗粒对去势雌性大鼠骨关节炎的影响观察

李 冰 杜义斌

(云南省中医医院， 昆明 650021)

骨疏颗粒对去势雌性大鼠骨关节炎的影响观察

李 冰 杜义斌

(云南省中医医院， 昆明 650021)

观察骨疏颗粒对去势雌性大鼠骨关节炎模型的性激素、炎性因子影响，以及骨疏颗粒治疗去势后雌性大鼠骨关节炎的疗效．将60只SD大鼠随机分为4组：模型组、正常对照组、戊酸雌二醇组、骨疏颗粒组．采用卵巢摘除联合过度运动制作骨关节炎模型，观察大鼠性激素、炎性因子改变．结果表明，与模型组比较，骨疏颗粒组及雌激素组均可以改善去势雌性大鼠性激素、炎性因子水平(P<0.01或P<0.05)，二者之间无显著差异(P>0.05)．骨疏颗粒能治疗和延缓去势雌性大鼠骨关节炎病变，与戊酸雌二醇无显著性差异．

骨关节炎； 骨疏颗粒； IL-1； IL-6； TNF-α； 实验研究

骨性关节炎(osteoarthritis， OA)是一种慢性退行性关节疾病，多见于中老年人，且女性多于男性，特别是绝经后妇女[1].中医认为肾为先天之本，脾胃为后天之本，气血生化之源，骨性关节炎的病机为肾气虚衰，脾失健运，脉络瘀阻．中医治疗骨性关节炎的主要方法就是补肾健脾活血，本实验研究观察补肾健脾活血方骨疏颗粒对去势雌性大鼠骨关节炎模型的影响．

1 材料与方法

1.1 动物与分组

选择8月龄SD雌性未孕大鼠60只，体重在250±50 g之间．由昆明医科大学动物实验中心提供，动物生产许可证号:SCXK(滇)2011-0004．在昆明医科大学动物实验中心实验室饲养，实验室室温18～22℃．随机分为4个组，分别为戊酸雌二醇组、骨疏颗粒组、正常对照组、模型组．

1.2 药品、试剂与仪器

1)药品．骨疏颗粒由狗脊、淫羊藿、炙黄芪、骨碎补、白术、熟地、三七、杜仲、陈皮、独活等组成，生药由云南中医医院制剂中心提供，并配制成颗粒剂．骨疏颗粒每袋重15 g(生药)，用蒸馏水按8.6 g/kg配制成2.5 mL药液灌胃．戊酸雌二醇(拜耳医药保健有限公司，1 mg*21片/盒，批号：095C)按0.1 mg/kg用蒸馏水配成2.5 mL溶液．本实验骨疏颗粒的用量为人正常用量的10倍．确定此用量是基于预实验中去势雌性大鼠骨关节炎出现变化的治疗剂量．

2)试剂．雌二醇(E2)、睾酮(T)、孕酮(P)、催乳激素(PRL)、卵泡生成激素(FSH)、黄体生成激素(LH)放射免疫试剂盒，由天津九鼎医学生物工程有限公司提供．生化指标试剂盒为武汉优尔生科技股份有限公司生产：IL-1，IL-6，TNF．使用ELISA法检测．

3)仪器．石蜡切片机(德国比CIA公司生产)，石蜡切片机刀片(德国ELICA公司产品)，组织贴片机(YT-6B湖北孝感亚光医用电子技术研究所)，包埋机(SHANDON)电热恒温T燥箱(上海跃进医疗器械厂)，普通光镜(尼康NIKONE200日本)放大倍数(×20)．

1.3 实验方法

1)造模方法．8月龄SD雌性大鼠60只，以2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，以最末肋骨所对应之椎体为中点做背部正中纵行切口，向两侧牵拉切口，分别于脊柱两侧切开肌层，显露两侧肾脏，于其下找到卵巢并切除，止血后缝合切口．卵巢送病理切片确定切除完整．正常对照组大鼠步骤同前，切除卵巢旁部分脂肪，不切除卵巢．考虑动物可能有死亡，各组多备2只大鼠，确保实验分组均为15只，术后3 d内每日给予80万单位青霉素肌注预防感染，分笼饲养，在(24±2)℃、通风良好、湿度60%～70%的实验条件下标准鼠饲料喂养，自由摄水．切口愈合后将动物置于电动滚轮上，驱使动物行走，10 min/次，2次/d．

2)给药方法．在大鼠接受造模处理12周后，开始进行药物的灌胃．空白对照组和模型组大鼠各自灌服2.5 mL生理盐水．戊酸雌二醇组和骨疏颗粒组大鼠称重，灌服配置药液2.5 mL，分别于第4周、第8周、第16周结束时，每组随机处死5只大鼠取血及关节液标本．

3)观察指标及检测方法．于用药后第4、第8、第16周3个时相点测定关节液中IL-1、IL-6及TNF-α含量及血清性激素水平(ELISA法)．观察大鼠左膝关节病理切片变化．

2 结 果

造模的60只雌性大鼠，伤口均愈合良好，无感染、出血、溃疡等情况．造模后第2～3 d，大鼠进食、饮水均较术前减少，大便稀软；造模12周后存活的大鼠未见明显异常，灌胃期间模型组大鼠精神略显差，体毛干枯不齐，其余各组表现不明显．

2.1 各组大鼠血清性激素水平的比较

与正常对照组比较，模型组、戊酸雌二醇组、骨疏颗粒组E2水平有明显降低(P<0.01)，表明造模成功．组间比较，戊酸雌二醇组、骨疏颗粒组与模型组比较E2水平有明显升高(P<0.01)，但未达到正常水平．戊酸雌二醇组与骨疏颗粒组之间无明显差异(P>0.05)．与正常对照组比较，戊酸雌二醇组、骨疏颗粒组T水平降低(P<0.05)．戊酸雌二醇组与骨疏颗粒组无明显差异(P>0.05)．与正常对照组比较，戊酸雌二醇组、骨疏颗粒组P，PRL水平降低(P<0.05，P<0.01)，骨疏颗粒组较戊酸雌二醇组降低(P<0.05)，与模型组无明显差异(P>0.05)．LH，FSH水平4组之间无明显差异(P>0.05)(见表1)．

2.2 各组大鼠膝关节液IL-1β水平的第4、8、16周比较

第4周戊酸雌二醇组与骨疏颗粒组无明显差异(P>0.05)，模型组较戊酸雌二醇组与骨疏颗粒组升高(P<0.05)，与正常对照组无明显差异．在第8、16周仅雌二醇组低于正常对照组(P<0.05)；骨疏颗粒组与戊酸雌二醇组之间无明显差异(P>0.05)(见表2).2.3 各组大鼠膝关节液IL-6水平的第4、8、16周比较

第4周骨疏颗粒组明显低于其他三组(P<0.05)，在第8、16周雌二醇组低于骨疏颗粒组(P<0.05)，均未达到正常对照组水平(见表3).

2.4 各组大鼠膝关节液TNF-α水平的第4周、8周、16周比较

骨疏颗粒组明显低于其他三组(P<0.05)(见表4).

表1 各组第16周大鼠血清性激素水平比较

注：各组平均数间，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著．

表2 各组大鼠膝关节液IL-1β水平的第4周、8周、16周比较

注：各组平均数间，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著．

表3 各组大鼠膝关节液IL-6水平的第4周、8周、16周比较

注：各组平均数间，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著．

表4 各组大鼠膝关节液TNF-α水平的第4周、8周、16周比较

注：各组平均数间，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著．

2.5 各组大鼠膝关节滑膜病理改变

如图1所示，骨疏颗粒组的关节软骨细胞有明显的成团聚集趋势，修复关节软骨．正常对照组关节滑膜上皮细胞明显增生，细胞浆增多，无炎症．戊酸雌二醇组关节滑膜上皮细胞增生，粘膜层有少量脂肪，无炎症．骨疏颗粒组关节滑膜上皮细胞呈明显增生，无炎症．对照组关节滑膜上皮细胞呈单层，粘膜层有多量脂肪，无炎症．

图1 大鼠膝关节滑膜病理改变(×20，HE)

2.6 各组大鼠膝关节滑膜及软骨病理改变

如图2所示，正常对照组关节软骨细胞有成团聚集趋势，细胞肥大，胞核增大，使关节面不平滑．戊酸雌二醇组关节软骨细胞有成团聚集趋势，细胞肥大，胞核增大，使关节面不平滑．骨疏组节软骨细胞有成团聚集趋势，细胞肥大，胞浆增多，胞核增大，使关节面不平滑．对照组关节软骨细胞有成束聚集，软骨中有钙盐沉积灶．

图2 大鼠膝关节软骨病理改变(×20，HE)

3 讨 论

在OA的多种致病因素中，比较重要的是炎性细胞产生的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α．炎性因子可导致关节腔内的炎性反应，消耗和破坏软骨，使骨质裸露，引起关节失去正常结构及功能[2]．其中IL-1β不仅促进透明软骨型胶原的降解，还促进纤维软骨型胶原的增生，是直接介导软骨破坏的细胞因子之一[3]．IL-6主要通过促进淋巴细胞分泌免疫球蛋白，从而导致关节和滑膜炎症的加重，软骨基质缺失[4]．TNF-α能使软骨蛋白多糖降解和合成减少，致关节软骨损害及骨质破坏，关节强直[5]．王乐平等[6]认为与骨关节炎发病相关的炎性因子如白细胞介素1(IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF-α)是引起软骨分解的主要机制．

绝经期妇女雌激素水平明显降低，相关炎症因子明显增高，骨关节炎的发病率升高[1]，雌激素替代疗法可以降低炎症因子水平，降低绝经后妇女骨关节炎发病率，改善关节炎症状[7-8]，但雌激素的副作用使其应用受到了限制．骨关节炎在中医辨证属于“痹症”的范畴，其病机主要为妇女绝经后肾精不足，脾失健运，脉络瘀阻．故而绝经期妇女骨关节炎应以补肾健脾、活血化瘀为治法．骨疏颗粒是云南省中医医老年科院治疗绝经期妇女的骨关节炎验方，主要由狗脊、骨碎补、淫羊藿、炙黄芪、白术、熟地、三七、杜仲、陈皮、独活等药物组成的．验方中君药为狗脊、淫羊藿有益气力，强志，坚筋骨，元阳振作之功；骨碎补、杜仲、熟地为臣药，补肝肾强筋骨，助狗脊、淫羊藿以增强补肾之功；黄芪、白术、陈皮为佐药，健脾以养后天并兼有祛痰除湿之功；羌活、独活为使药，养血生精活血，通络定痛．在临床上，骨疏颗粒治疗妇女绝经期骨质疏松有良好的疗效[9-11]，通过动物实验发现骨疏颗粒可升高去势雌性大鼠雌激素的水平[11]．

本实验切除雌性大鼠双侧卵巢16周后，戊酸雌二醇组和骨疏颗粒组的E2水平接近正常，戊酸雌二醇组、骨疏颗粒组T、P水平明显降低．戊酸雌二醇组、骨疏颗粒组、正常对照组PRL、LH水平相似．FSH在4组之间无明显差异．戊酸雌二醇组、骨疏颗粒组、正常对照组大鼠膝关节液IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型组(P<0.05)，骨疏颗粒组大鼠膝关节液TNF-α水平明显低于其他三组．

骨疏颗粒通过升高雌激素水平，降低炎性因子水平，减轻去势大鼠骨关节炎的炎症反应，与戊酸雌二醇相比，骨疏颗粒对于关节软骨的修复作用更佳．本实验另外一个发现，骨疏颗粒并未提高睾酮的水平，骨疏颗粒含有狗脊、淫羊藿、骨碎补，在多个实验研究中均提示淫羊藿、狗脊、骨碎补含有黄酮类化合物[12-14]，对雄性大鼠有升高雄激素的作用[15]，对骨质疏松、骨关节炎具有良好的治疗作用，但是本实验雌性大鼠的睾酮水平降低，提示骨疏颗粒并非通过影响去势雌性大鼠体内雄激素水平来治疗骨关节炎．

[1] 吕厚山，孙铁铮，刘忠厚．骨关节炎的诊治与研究进展[J]．中国骨质疏松杂志，2004，10(1)：7-22．

[2] 燕 军，节晓光，孟 江．苗药荣筋汤治疗兔KOAIL-1β、TNF-α水平观测[J]．中国中医骨伤科杂志，2009，17(7)：5-6．

[3] Pelletier J P， DiBattista J A， Roughley P， et al． Cytokines and inflame mation in cartilage degradation[J]． Rheum Dis Clin North Am， 1993， 19 ：545-568．

[4] 张永亮，宓轶群，刚嘉鸿，等．细胞因子与针灸治疗膝骨关节炎：实验与应用[J]．中国组织工程研究，2014，18(24):3906-3911．

[5] Oegema Trhr， Lewis J L， Thompson R C Jr． Role of Acute Main Development of Osteoarthritis[J]． Agents Actions， 1993， 40(3/4)：220．

[6] 王平乐，董秋梅．中医药治疗骨关节炎机制研究进展[J]．贵阳中医学院学报，2009，31(6)：73-76．

[7] 郭欣宇，马 英，曾 艳，等．绝经期骨性关节炎患者血浆性激素和细胞因子水平及其与膝关节功能的相关性[J]．中国全科医学，11(5B)：852-854．

[8] 高 峰，杜 宁．雌激素受体与骨性关节炎[J]．医学综述，2008，14(1):33-35．

[9] 刘慧萍，陈明辉，李 玲，等．补肾活血方含药血清对卵巢颗粒细胞ActA/Smads信号通路的影响[J]．时珍国医国药，2016，27(12):2857-2861．

[9] 杜义斌，徐翔峰，彭江云．骨疏颗粒治疗老年女性骨质疏松症30例疗效观察[J]．云南中医中药杂志，2006，27(5)：15．

[10] 杜义斌，吴 洋，段艳蕊，等．骨疏颗粒治疗绝经后骨质疏松症临床观察[J]．新中医，2013，45(8)：18-21．

[11] 李 冰，杜义斌，李黔云，等．骨疏颗粒对去卵巢雌性大鼠骨质疏松的影响[J]．云南中医学院学报，2014，37(4)：9-12．

[12] 蒋 俊，崔 莉，孙 娥，等．基于淫羊藿黄酮类化合物的体内代谢阐述其抗骨质疏松药效物质基础[J]．中草药，2014，45(5)：721-729．

[13] 杨慧洁，吴 琦，杨世海．金毛狗脊化学成分与药理活性研究进展[J]．中国实验方剂学杂志，2010，16(15)：230-234．

[14] 刘玲玲，曲 玮，梁敬钰．骨碎补化学成分和药理作用研究进展[J]．海峡药学，2012，24(1)：4-9．

[15] 郑 娟，徐思凡，刘庆山．植物药黄酮类成分对睾丸功能的影响[J]．辽宁中医药大学学报，2009，11(3)：39-41．

[责任编辑 周文凯]

水利与环境学院鱼类过坝技术博士生国际学术交流会在我校举行

2017年4月21日，南安普顿大学博士生、三峡大学水利与环境学院来华留学博士生在我校水利与环境学院水电楼学术报告厅举办了水利与环境学院鱼类过坝技术博士生国际学术交流会。就鱼类过坝相关技术、水环境与水资源保护等相关内容进行学术研讨，包括过鱼设施简介及设计水力学要求、鱼类游泳与鱼道设计、过鱼设施效果监测与评价、河道修复与环境保护、水资源利用与保护等相关内容。

(转载自三峡大学校园网)

Experimental Study of Effects of Gushu Granules on Osteoarthritis of Ovariectomized Osteoporotic Model Rats

Li Bing Du Yibin

(Yunnan Provincial College of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650021，China)

Objective To investigate the effect of Gushu granules on osteoarthritis ovariectomized osteoporotic model rats. In order to provide experimental basis for clinical application of Gushu granules and further study. 60 SD rats were randomly divided into 4 groups i.e. model group, normal control group, estrogen group and group of Gushu granules. The osteoporosis model was induced by ovariectomy and overexercise. the change of sex hormone and inflammatory factor in rads were observed after the rats were treated with Gushu granules and estradiol valerate. The experimental results show Gushu granules and estradiol valerate could increase the level of sex hormone and reduce inflammatory factor of osteoarthritis model rats(P<0.01 orP<0.05). Significant difference is compared with model group (P<0.05). There is no significant difference between the two(P>0.05). It is concluded that the Gushu granules could treatment and delay osteoarthritis. There is no significant difference with estradiol valerate.

osteoarthritis; Gushu granules; IL-1; IL-6; TNF-α; experimental study

2017-03-21

云南省教育厅科学研究基金项目(课题号：2014Z124)；云南省卫生科技计划项目(课题号：2014NS334)

李 冰(1974-)，女，主治医师，主要从事老年病的中医药防治研究．E-mail：dybys@126.com

10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2017.03.024

R285.5

A

1672-948X(2017)03-0108-05