喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地牧羊犬耶尔森菌感染和携带状况初步调查

徐大琴，席进孝，王鼎盛，郭丽民，吴 斌，盖永志，穆洮霞



喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地牧羊犬耶尔森菌感染和携带状况初步调查

徐大琴，席进孝，王鼎盛，郭丽民，吴 斌，盖永志，穆洮霞

目的 了解喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地牧羊犬耶尔森菌感染和携带状况，探讨3种致病性耶尔森菌在自然界是否存在替代或拮抗关系，为鼠疫防控提供新方法。方法 采集喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地牧羊犬血清、肛拭子标本进行致病性耶尔森菌的检测与分析。结果 检测阿克塞县、肃北县、肃南县、天祝县牧羊犬血清分别为88、94、70、64份，阳性率分别为31.82%(28/88)、32.98%(31/94)、2.86%(2/70)、1.56%(1/64)。采集阿克塞县、肃北县、肃南县、天祝县的牧羊犬肛拭子共171份进行致病性耶尔森菌分离，动物间鼠疫流行猛烈的阿克塞、肃北分别分离出1株克氏耶尔森菌和2株非致病性小肠结肠炎耶尔森菌。结论 喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地动物间鼠疫流行猛烈地区的牧羊犬感染和携带非致病性小肠结肠炎耶尔森菌。

旱獭鼠疫自然疫源地；牧羊犬；耶尔森菌；调查分析

耶尔森菌属属于肠杆菌科，包括18个菌种，其中对人和动物具有致病性的有3种:鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌。有研究表明这3种致病性耶尔森菌具有共同位于毒力质粒上的V抗原，感染其中某一种致病性耶尔森菌后，机体就会获得保护性免疫，不会再感染其他种致病性耶尔森菌[1]。如在我国甘宁黄土高原鼠疫疫源地家鼠和农家周边的野鼠体内检测不出鼠疫耶尔森菌，但小肠结肠炎耶尔森菌携带率却很高，而在内蒙古高原鼠疫疫源地中家、野鼠小肠结肠炎和假结核携带率很低，但却有鼠疫的发生和流行[2]。牧羊犬不仅是鼠疫的指示动物，而且也是小肠结肠炎耶尔森菌的主要储存宿主和主要传染源[3-5]，本文通过初步调查喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地牧羊犬耶尔森菌感染和携带状况，能够为探讨甘肃省鼠疫耶尔森菌与小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌之间的关系提供初步依据，为甘肃鼠疫防控提供新思路。

1 材料和方法

1.1 标本来源：2013-2015年采集阿克塞县、肃北县、肃南县、天祝县牧羊犬血清分别为88、94、70、64份(见表2)，肛拭子标本分别为50、45、73、68份。

1.2 菌株分离及鉴定 参考文献[6]方法采集和处理牧羊犬血清，并检测血清中鼠疫F1抗体。试剂配制及操作按说明书进行，判定标准参照中华人民共和国卫生行业标准《鼠疫诊断标准WS 279-2008》。采集的牧羊犬肛拭子标本，参考文献[7]方法将标本置于PBS培养基中，4 ℃ 20 d后，使用细菌基因组提取试剂盒(Tiangen, china)提取样本核酸，进行foxA，ail，inv基因的扩增。参考文献[8]方法将foxA，ail，inv基因阳性标本接种于选择性平板(CIN agar,Difco)，进行分离培养,并采用Api20E肠杆菌鉴定系统对菌株进行进一步的血清分型，生物分型鉴定参考文献[8-9]方法检测小肠结肠炎耶尔森菌分离株毒力基因ail、ystA、ystB、yadA、virF、rfbC以确定菌株的致病性。各种毒力基因特异性引物系列及扩增条件见表1。

表1 引物序列及扩增条件
Tab.1 Primer sequences and amplification conditions

引物Primer引物序列(5'→3')Primersequence产物大小Size/bp退火温度Annealingtemperature/℃ailForwardTAATGTGTACGCTGCGAG35157ReverseGACGTCTTACTTGCACTGystAForwardATCGACACCAATAACCGCTGAG7961ReverseCCAATCACTACTGACTTCGGCTystBForwardGTACATTAGGCCAAGAGACG14661ReverseGCAACATACCTCACAACACCyadAForwardCTTCAGATACTGGTGTCGCTGT84960ReverseATGCCTGACTAGAGCGATATCCvirFForwardGGCAGAACAGCAGTCAGACATA56163ReverseGCTGAGCATAGAGAATACGTCGrfbCForwardCGCATCTGGGACACTAATTCG40555ReverseCCACGAATTCCATCAAAACCACC

1.3 主要试剂和仪器 改良磷酸盐缓冲液(PBS)(购自Fluka, peptone sorbitol bile broth),脑心浸液培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司)，小肠结肠炎耶尔森菌选择性培养基(购自OXOID,Yersiniaselective agar base)Api20E生化鉴定条(购自法国生物梅里埃公司 bioMérieux)细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)(购自天根生化北京有限公司)，PCR扩增用Premix Tap酶(Version 2.0 plus dye)、2000 bpDNA Ladder(DL2000)购自TaKaRa公司。琼脂糖为BioWest公司，分型血清购自日本生研株式会社。生物安全柜(SG403INT型、The Baker Company)、PCR仪为德国senso梯度PCR仪LabCycler Standard plus型，台式高速离心机为德国Eppendorf公司Eppendorf centrifuge5415D，电泳仪(DYY-C6型，北京六一仪器厂)，凝胶成像仪为美国伯乐(Bio-Rad公司)GEL Doc2000。间接血凝试剂由吉林博德医学免疫制品有限公司提供(No.20130101)。

2 结 果

2.1 牧羊犬血清F1抗体 从2013年至2015年，我们在喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地阿克塞县、肃北县、肃南县、天祝县分别采集了88、94、70、64份牧羊犬血清，阳性率分别达到了31.82%(28/88)、32.98%(31/94)、2.86%(2/70)、1.56%(1/64)，其中2015年阿克塞、肃北牧羊犬血清血凝最高抗体滴度均达到1∶1 280，提示本地区动物间鼠疫流行猛烈(按鼠疫自然疫源地及动物鼠疫流行判断标准，GB 16883-1997)。肃南和天祝只有2013年检出有阳性血清，最高抗体滴度为1∶128，尚未达到判定动物间鼠疫流行猛烈标准。

表2 2013年-2015年牧羊犬血清F1抗体检验结果
Tab.2 Serum F1 antibody test results of shepherd dog from 2013 to 2015

年份Year阳性率(%)Positiverate阿克塞Akesai肃北Subei肃南Sunan天祝Tianzhu201325(5/20)55.88(19/34)6.67(2/30)5(1/20)201412.90(4/31)16.67(5/30)0(0/20)0(0/23)201551.35(19/37)23.33(7/30)0(0/20)0(0/21)Total31.82(28/88)32.98(31/94)2.86(2/70)1.56(1/64)

2.2 分离菌株及菌株生化鉴定、分型及毒力检测 采集甘肃省鼠疫自然疫源地阿克塞县、肃北县、肃南县、天祝县地区牧羊犬肛拭子标本分别为57、64、30、20份进行小肠结肠炎耶尔森菌分离，结果分离出2株小肠小肠结肠炎耶尔森菌，1株克氏耶尔森菌，分离率分别为2%(1/50)、4.44%(2/45)、0%(0/30)、0%(0/20)，见表3。对分离到的菌株进行API 20E生化鉴定条鉴定，2株生物型均为1A型非致病性小肠结肠炎耶尔森菌,其毒力基因特征为ail-ystA-ystB-yadA-virF-rfbc-和ail-ystA-ystB+yadA-virF-rfbc-[8-9]，1株为克氏耶尔森菌。

表3 菌株分离情况
Tab.3 Strains of isolation

分离地点Location分离率(%)Separationrate生化鉴定结果Biochemicalidentificationresults小肠结肠炎耶尔森菌Yersiniaenterocolitica克氏耶尔森菌Yersiniakristensenii阿克塞Akesai2(1/50)-1肃 北Subei4.44(2/45)2-肃 南Sunan0(0/30)--天 祝Tianzhu0(0/20)--

注：“-”代表未分离出菌株

Note: "-" represents not isolated strains

3 讨 论

牧羊犬是喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地牧民必不可少的好助手，它在牧场主要负责警卫，如避免牛、羊、马等逃走或遗失、保护家畜免于熊或狼的侵袭，杜绝偷盗行为等，因其活动范围广，又有叼食啮齿动物或尸体和搜寻嗅猎洞穴的习惯，染疫风险高，放牧人主要通过与其密切接触感染、发病[3-10]，牧羊犬也是鼠疫的一种高抗动物[11]，通过检测犬体内鼠疫F1抗体，可以预测和预警鼠疫的发生、发展过程、流行强度和范围，因此，我国把检测牧羊犬血清F1抗体列入了鼠疫监测方案。本次调查来自阿克塞县、肃北县、肃南县、天祝县采集的牧羊犬血清，阳性率分别达到了31.82%(28/88)、32.98%(31/94)、2.86%(2/70)、1.56%(1/64)，其中阿克塞、肃北牧羊犬血清血凝最高抗体滴度均达到1∶1 280，而肃南县、天祝县牧羊犬血清血凝最高抗体滴度均只达到1∶128，结果提示阿克塞县、肃北县两地区动物间鼠疫流行猛烈。这与阿克塞县、肃北县鼠疫监测结果显示一致：即阿克塞县最近一次人间鼠疫发生在2010年，动物间疫情流行呈逐年上升趋势，尤其从活体旱獭及媒介昆虫检出多株鼠疫菌，疫情呈多点爆发流行态势；肃北县近年来动物间鼠疫流行连绵不断呈上升趋势，在旱獭刚出蛰就有大量旱獭死亡，检菌地点范围有所增加，疫情呈多点爆发流行，并分别于2007年、2014年各发生2次4起人间鼠疫。

有学者认为由于3种致病性耶尔森菌具有共同位于毒力质粒上的的V抗原，感染某一种致病性耶尔森菌后会获得保护性免疫，当再次暴露在其他种致病性耶尔森菌污染的环境中不会发生感染[1]。牧羊犬不仅是鼠疫的高抗动物[11]，同时也是小肠结肠炎耶尔森菌的主要储存宿主和主要传染源[3-5]，研究表明[12]小肠结肠炎耶尔森菌在中国分布广泛，云南、宁夏、青海等省份均从鼠疫耶尔森菌的疫源地分离出小肠结肠炎耶尔森菌[13-14]。因此，我们采集喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地牧羊犬肛拭子，进行牧羊犬耶尔森菌感染和携带状况的调查。本次调查分别采集自喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地阿克塞县、肃北县、肃南县、天祝县4个县牧羊犬肛拭子共171份进行耶尔森菌的分离。阿克塞县共采集57份牧羊犬肛拭子，分离出1株克氏耶尔森菌。肃北共采集64份牧羊犬肛拭子，分离出2株小肠结肠炎耶尔森菌，生物型均为1A型。但是，从这3份分离出小肠结肠炎耶尔森菌的牧羊犬采集的血清鼠疫F1抗体结果却是阴性，且未能从阿克塞28份、肃北31份牧羊犬血清鼠疫F1抗体结果是阳性的肛拭子标本中分离到小肠结肠炎耶尔森菌。是否因牧羊犬携带了小肠结肠炎耶尔森菌而阻止了鼠疫耶尔森菌的感染，或携带了鼠疫耶尔森菌而阻止了小肠结肠炎耶尔森菌的感染，我们将对该疫源地的主要宿主动物旱獭携带耶尔森菌情况做进一步的研究。自肃南县采集牧羊犬肛拭子73份，却未分离出小肠结肠炎耶尔森菌及假结核耶尔森菌。肃南县1961年首次在康乐乡杨哥村扎科旱獭体内检出鼠疫菌后，被确定为喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地，近10年发生动物疫情15起，未发生人间鼠疫疫情，属现疫鼠疫疫源县。虽然该疫源地动物间鼠疫疫情流行弱，发生人间鼠疫的风险较阿克塞、肃北低，但肃南县疫源面积大，分布广，随着旅游业、矿业、水能资源的开发，疫区人员流动频率增加，人员复杂，也为我们鼠疫防控工作带来了新的挑战，因此，我们将对该疫源地进行进一步的研究。祁连山东段的天祝县共68份牧羊犬肛拭子，却未分离出小肠结肠炎耶尔森菌及假结核耶尔森菌。天祝县自1963年从一只旱獭体内分离出鼠疫菌，在此后的50多年间既未检出鼠疫菌，也没有发现具有流行病学意义的抗体滴度，虽然2013年牧羊犬检出1个血清阳性，抗体滴度达到了1∶128，但是尚不能说明该疫源地动物间鼠疫流行。

是否因为这次采集的牧羊血清样本量小，不足以得出3种致病性耶氏菌在自然界是否存在替代或拮抗关系的结论。我们将对该疫源地进行进一步的研究。通过本次调查研究，我们共分离到2株小肠结肠炎耶尔森菌和1株克氏耶尔森菌，均为不致病性小肠耶尔森菌。究竟甘肃鼠疫疫源地内主要宿主携带的3种致病性耶尔森菌关系如何,我们仍需做进一步的研究。

[1] Fukushima H, Hao Q, Wu K, et al.YersiniaenterocoliticaO9 as a possible barrier againstY.pestisin natural plague foci in Ningxia, China[J]. Curr Microbiol, 2001, 42(1): 1-7.

[2] Chen SY, Guo Y, Zhang HP, et al. Investigation ofYersiniaenterocoliticain wild plague foci in Jianchuan, Yunnan[J]. Dis Surveill, 2016, 31(2): 141-144. DOI: 10.3784 /j.issn.1003-9961. 2016.02.013 (in Chinese)

陈双艳，郭英，张海鹏，等.2013-2014年云南省剑川县野鼠鼠疫疫源地小肠结肠炎耶尔森菌的调查分析[J].疾病监测, 2016, 31(2):141-144.

[3] Ge P, Xi J, Ding J, et al. Primary case of human pneumonic plague occurring in aHimalayanmarmotnatural focus area Gansu Province, China[J]. Intl J Infect Dis, 2015, 33: 67-70. DOI:10.1016/j.ijid.2014.12.044

[4] Wang X, Liang JR, Xi JX, et al.Canislupusfamiliaris involved in the transmission of pathogenicYersiniaspp. in China[J]. Vet Microbiol, 2014, 172(1/2): 339-344.DOI:10.1016/j.vetmic.2014.04.015

[5] Wang X, Cui Z, Wang H, et al. Pathogenic strains ofYersiniaenterocoliticaisolated from domestic dogs (Canisfamiliaris) belonging to farmers are of the same subtype as pathogenicY.enterocoliticastrains isolated from human and maybe a source of human infection in Jiangsu province, China[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(5): 1604-1610. DOI:10.1128/JCM.01789-09

[6] Zhang Y, Dai X, Wang X, et al. Dynamics ofYersiniapestisand its antibody response in great gerbils (Rhombomysopimus) by subcutaneous infection[J]. PLoS One, 2012, 7(10): e46820. DOI:10.1371/journal.pone.0046820

[7] Liang JR, Wang X, Xiao YC, et al. Prevalance ofYersiniaenterocoliticain pigs slaughtered in Chinese abattoirs[J]. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(8): 2949-2956.DOI:10.1128/AEM.07893-11

[8] Wang X, Qiu H, Jin D, et al. O:8serotypeYersiniaenterocoliticastrains in China[J]. Int J Food Microbiol, 2008, 125: 259-266. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2008.04.016

[9] Thoerner P, Bin Kingombe CI. PCR detection of virulence genes inYersiniaenterocoliticaandYersiniapseudotuberculosis and investigation of virulence genes distribution[J]. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(3): 1810-1816.

[10] Rust JH Jr, Miller BE, Bahmanyar M, et al. The role of domestic animals in the epidemiology of plague. II. Antibody toYersiniapestisin sera of dogs and cats[J]. J Infect Dis, 1971，124(5):527-531.

[11] Xiao YC，WangX，Qiu HY，et al．Study of biotyping for pathogenicYenterocoliticastrains in china[J]．Chin J Zoonoses 2010,26(7)：651—653．DOI:1002-2694(2010)07-0651-03(in Chinese)

肖玉春，王鑫，邱海燕，等．中国致病性小肠结肠炎耶尔森菌生物分型研究[J]．中国人兽共患病学报，2010．26(7)：651-653．

[12] Qi T,Yang K,Wang LM,et al. pidemiology Shiqu County,China,2001-2013[J]．Chin J Zoonoses,2015, 31(5): 485-488.DOI:10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.05.020(in Chinese)

祁腾, 杨孔, 汪立茂,等. 石渠县2001-2013年鼠疫疫源地流行病学分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2015, 31(5): 485-488.

[13] Chen WJ，Wang P. Epidemiological status and research ofYersiniaenterocoliticain China[J]．Chin J Zoonoses，2015, 31(4): 380-384.DOI:10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.019(in Chinese)

陈邬锦, 王鹏. 中国小肠结肠炎耶尔森菌流行现状及其研究进展[J]. 中国人兽共患病学报, 2015, 31(4): 380-384.

Yersiniainfection and carrier in shepherd dog on the natural foci ofMarmotahimalayanaplague

XU Da-qin, XI Jin-xiao, WANG Ding-sheng, GUO Li-min, WU Bin, GAI Yong-zhi, MU Tao-xia

(GansuProvincialCentreforDiseaseControlandPrevention,Lanzhou730000,China)

We studiedYersiniainfection and carriage in shepherd dog on the natural foci ofMarmotahimalayanaplague and investigated the substitution or antagonism relationship among three pathogenicYersiniain nature, providing a novel approach for prevention and control of plague. Blood sample and rectal swab specimens from shepherd dogs were collected. Rectal swab specimens were detected and isolated forY.enterocoliticanandY.pseudotuberculosis. IHA was used to measure the positive rate of F1 antibody. Results showed that among 88, 94, 70 and 64 serum specimens respectively from Akesai, Subei, Sunan, and Tianzhu, IHA positive rates were 31.82%, 32.98%, 2.86% and 1.56% separately. A total of 236 anal swab specimens of shepherd dog were collected, among which oneY.kristenseniistrain and 2 non-pathogenicY.enterocoliticastrain were recovered from Akesai and Subei respectively, where plague was violently prevalent in animals. All the results indicate that shepherd dogs in natural foci ofM.himalayanaplague where plague in animals are prevalent with non-pathogenicY.enterocolitica, is an evidence of antagonism relationship in three pathogenicYersinia.

natural foci ofMarmota; himalayana plague; shepherd dog;Yersinia; investigation and analysis

Xi Jin-xiao, Email: xijxxp@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.008

国家自然科学基金((No.81560541)资助

席进孝，Email:xijxxp@163.com

甘肃省疾病预防控制中心，兰州 730000

R378

A

1002-2694(2017)06-0513-04

2016-11-03 编辑：梁小洁

Supported by the National Science Foundation of China (No. 81560541)