异常黏液质证候大鼠阴茎组织差异性表达microRNA的筛选及生物信息学分析*

木萨•艾麦尔蒋 萍毛吾兰•买买提依明马文静美合日古丽•萨塔尔斯依提•阿木提王天宇阿地力江•伊明**

1.新疆医科大学基础医学院人体解剖学教研室（乌鲁木齐 830011）;

2.基础医学院生理学教研室; 3.基础医学院细胞生物学教研室; 4.中心实验室

·论 著·

异常黏液质证候大鼠阴茎组织差异性表达microRNA的筛选及生物信息学分析*

木萨•艾麦尔1△蒋 萍2△毛吾兰•买买提依明3马文静4美合日古丽•萨塔尔1斯依提•阿木提1王天宇1阿地力江•伊明1**

1.新疆医科大学基础医学院人体解剖学教研室（乌鲁木齐 830011）;

2.基础医学院生理学教研室; 3.基础医学院细胞生物学教研室; 4.中心实验室

目的 筛选异常黏液质证候及药物干预大鼠阴茎组织差异表达microRNA（miRNA），并验证miR-140-3p和miR-486两项关键指标，探讨其生物学意义。方法 取80只性功能正常SD雄性大鼠，从中随机抽取10只大鼠设为正常对照组，余70只为造模组，用芫荽实+菠菜实+湿寒性环境的干预条件建立异常黏液质证候模型，通过生物学表征确认模型成功后，随机分为证候模型组、证候药物组。伊木萨克片干预3周后，提取阴茎组织总RNA进行miRNA Illumina高通量测序，筛选出异常黏液质证候及药物干预相关的候选差异表达miRNA，实时荧光定量PCR验证测序结果的可靠性，并进行生物信息学分析。结果 筛选出证候相关miRNA候选标志物15个（上调13个，下调2个），伊木萨克片干预相关miRNA候选靶点标志物3个（均下调），验证结果显示miR-486在证候模型组较正常对照组表达升高（P＜0.05），miR-486和miR-140-3p在证候药物干预组较证候模型组表达降低（P＜0.05）。结论miR-486可作为异常黏液质证标志物，miR-140-3p、miR-486可作为伊木萨克片靶点标志物，但仍需大样本量验证。

异常黏液质证候; 微RNAs; 伊木萨克片; 计算生物学

维吾尔医学（维医）作为祖国传统医学宝库中的重要成员，在阳痿、早泄及少、弱精子症等男科疾病的诊疗中具有显著的临床诊疗优势。前期工作中，本研究团队，通过病因造模的理念成功建立了异常黏液质证大鼠模型，并从中成功筛选出阳痿病证模型，且系统研究了该证候与病证模型生物学表征、性行为能力与勃起功能改变。本研究则在此基础上，从阳痿维医临床主要证型异常黏液质证角度，采用Illumina Hiseq高通量深度测序分析技术，筛查了差异表达的microRNA，构建了候选标志物体系，对miR-140-3p和miR-486两项关键指标进行验证后，开展了生物信息学分析，从证候角度探讨了异常黏液质型阳痿病证的发病机制及其上述指标可能的作用，现具体报道如下。

材料与方法

一、实验动物

80只具有正常性能力的性成熟期SD雄性大鼠，体质量（250±25）g。20只性成熟雌性大鼠（去势），体质量（180±15）g，由新疆医科大学实验动物中心提供。大鼠自由饮食水，12h/12h昼夜交替饲养，动物饲养环境温度（18~22）℃，相对湿度50%~60%。

二、实验试剂与材料

湿寒性饲料（新疆医科大学动物中心制备）；阿朴吗啡（Apomorphine，APO，美国Sigma公司）、戊巴比妥钠（美国sigma公司，批号：P013601）；黄体酮（宁波市三生药业有限公司，批号：S151009）；雌二醇（宁波市三生药业有限公司，批号：B130613）；伊木萨克片（新疆和田维吾尔药业有限责任公司，批号：20151202）；miRneasy Mini Kit （批号：154027952）、miScriptⅡ RT Kit（批号：154032004）、miScript SYBR Green PCR试剂盒（批号：154034292）、U6引物（批号：20160831012s）、rno-miR-140引物（批号：20140905186）、rno-miR-486引物（批号：20160427117）均购自德国QIAGEN公司。

三、实验仪器

RXZ-436LD型人工气候箱（宁波江南仪器厂），5810R型低温离心机（德国Eppendorf公司），LT3002E 型电子天平（北京赛多科斯天平有限公司），超低温冰箱（青岛海尔公司），IQ2实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司），梯度PCR仪（美国Bio-Rad公司），Nanodrop 2000微量分光光度计（美国Thermo Scientific公司），高压灭菌锅（日本TOMY 公司）。

四、实验方法

（一）动物模型的建立和分组

1. 建立动物模型：随机取10只雄性SD大鼠为正常对照组（N），余70只为造模组。按照前期工作[1]制作异常黏液质证候大鼠模型，从中筛选出阳痿病证模型（用于其它研究），

2. 分组：异常黏液质证候模型未成阳痿大鼠随机分为证候模型组（ZM）和证候药物组（ZY）。证候药物组伊木萨克片干预剂量为250mg/kg灌胃，每日1次，证候模型组为等剂量溶剂干预，时间3周。

（二）取材

实验终结时，1%戊巴比妥钠腹腔注射（40mg/kg）麻醉后，剪取阴茎组织，去除筋膜，纵向剖开分为两半分装，液氮速冻后，-80℃冻存。

（三）miRNA测序分析

正常对照组、证候模型组和证候药物组3组，每组取3个阴茎组织样本构成混合样本，干冰保存，寄送至深圳华大基因有限公司，委托其进行miRNA测序及数据分析。过程简述如下：（1）提取样品总RNA，使用PAGE胶分离不同片段大小的RNA。切取18~30nt 之间的条带，回收Small RNA；（2）配制3’连接体系，连接并纯化回收连接产物；（3）配制5’连接体系，连接并纯化回收连接产物；（4）RTPCR扩增，使用PAGE胶回收纯化PCR产物，回收产物溶于EB solution，完成文库构建；（5）构建好的文库使用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCRSystem检测质量和产量。使用Illumina HiSeq测序系统进行测序，经生物信息学分析，通过过滤比对，除去其他的非编码RNA，通过与miRBase 21.0数据库进行对比，注释miRNAs。

（四）大鼠阴茎组织总RNA提取

取50mg组织在研钵中研磨成粉末，放入1.5mL离心管，按照miRneasy Mini Kit试剂盒说明书进行操作，提取总RNA，Nanodrop 2000微量分光光度计测量总RNA浓度。

（五）实时荧光定量PCR（Real-Time qPCR）

按照QIAGEN公司的miScriptⅡRT 试剂盒操作说明将1μg总RNA反转录为cDNA。依据miScript SYBR Green PCR试剂盒说明书操作，以50ng cDNA为模板，U6为内参，进行PCR扩增。条件：95℃预变性15min入循环，94℃变性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，循环数40， 4℃ 5min。数据分析采用2-ΔΔCt法将不同样本的RQ值（RQ=2-ΔΔCt）进行比较分析，其中△Ct=Ct目的miRNA-CtU6，△△Ct=△Ct实验组-△Ct正常对照组。2-ΔΔCt为两者模板中相应目的miRNA含量的相对比值。每个样本重复3次。

（六）差异表达的miRNA靶基因预测

用Targetscan、miRDB以及miRanda等3个数据库对差异表达的miRNA靶基因同时进行预测，取3个靶基因预测软件的交集进行分析。

（七）miRNA靶点的通路分析

通过用the Gene Ontology（http://www. geneontology.org/）对其靶基因进行功能显著性富集分析；用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（http://www.kegg.jp/）预测其可能的靶基因和信号通路。

五、统计方法

使用SPSS 17.0统计软件处理。计量资料描述用均数±标准差，多组数据间进行均衡性检验后，行方差齐性检验和正态性检验，如满足方差分析要求，多组之间数据比较采用单因素方差分析（one way analysis of variance，one way ANOVA），如不能满足方差分析要求，则求出秩次后进行方差分析，检验水准α=0.05。

结 果

一、差异表达miRNA结果

证候模型组与正常对照组相比，显著差异的miRNA有147个，其中以log2 Ratio的绝对值＞0.8为条件，进行综合分析，构建阴茎组织miRNA候选标志物15个，其中上调13个，下调2个（表1）。证候药物干预组显著差异的miRNA有131个，其中以log2 Ratio的绝对值＞0.8为条件，结合综合分析，构建miRNA药物候选靶点标志物3个，均为下调（表2）。在15个证候指标中，miR-434-3p、miR-486被药物反向调控，提示上述2个miRNA在该证候发生中发挥重要作用。

表1 异常黏液质证候大鼠阴茎组织候选miRNA标志物

表2 药物干预异常黏液质证候大鼠阴茎组织候选miRNA标志物

二、miR-140-3p、miR-486的实时荧光定量PCR验证结果

结果显示，miR-486表达水平在证候模型组较正常对照组显著升高（P＜0.05），经药物干预后，与证候模型组显著降低（P＜0.05）（图1）；miR-140-3p相对表达水平与正常对照组相比虽有升高，但组间差异无统计学意义（P＞0.05），经药物干预后，表达显著下调（P＜0.05）（图2）。

图1 miR-486在各组的相对表达水平注：与N组比较，*P＜0.05；与ZM组比较，#P＜0.05

图2 miR-140-3p在各组的相对表达水平注：与ZM组比较，#P＜0.05

三、miR-140-3p、miR-486的靶基因预测结果

结果显示，miR-140-3p用Targetscan、miRDB以及miRanda 3个靶基因预测软件同时进行预测， miR-140-3p有30个预测靶基因，miR-486有21个预测靶基因（表3）。

四、miR-140-3p、miR-486靶基因的GO分析

结果显示，miR-140-3p主要涉及调节大分子物质的代谢过程、调节基础代谢过程、调控细胞代谢过程、蛋白质代谢过程、G蛋白偶联受体信号通路。miR-486主要涉及细胞蛋白质的修饰作用、细胞的代谢过程的正性调控、程序性细胞死亡、代谢过程正性调控、胆固醇代谢（表4、表5）。

表3 差异表达的microRNA的靶基因

表4 miR-140-3p预测靶基因生物学功能

表5 miR-486预测靶基因生物学功能

五、miR-140-3p、miR-486靶基因的pathway分析

结果显示，miR-140-3p主要参与Wnt信号通路、TGF-β信号通路、促性腺激素信号通路、神经营养因子信号通路、B细胞受体信号通路、丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶信号通路等。miR-486主要参与抗利尿激素调节的水分重吸收作用、肌动蛋白细胞骨架调节、缝隙连接、神经营养因子信号通路、泛素蛋白介导的水解作用（表6、表7）。

表6 miR-140-3p预测靶基因pathway分析

表7 miR-486预测靶基因pathway分析

讨 论

在维医学在内的传统医学中，阳痿是男性阴茎不举或举而不坚为主要特征的病症，并可伴有性欲减低和早泄等症状，在现代医学中阳痿被称之为阴茎勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED），阴茎不能获得或维持充分的勃起，并持续影响性生活 6 个月以上的生理功能障碍。在长期医学实践中，维医对阳痿形成了一定的理论建树和较为成熟的诊疗优势，且以疗效显著著称。在以往研究工作中，我们选择阳痿维医临床主要证型异常黏液质证作为切入点，在维医基础理论和造模理念的指导下，采用湿寒饲料、湿寒环境（高湿和低温）等多因素复合刺激的病因造模方法，建立了异常黏液质证（证候）大鼠模型，并成功筛选出阳痿（病证结合）模型，以自然恢复和对证方药干预法，进行了反证和系统评价，证明该模型成功地模拟了阳痿病证的临床特征[2]。在对其生殖生物学基础的研究过程中，发现该证候及阳痿病证大鼠模型阴茎海绵体平滑肌组织纤维化，并出现一系列信号转导途径调控异常，尤其是阴茎组织NO-cGMP-PDE5和VIP、CGRP-cAMP、RhoA/Rho等信号转导途径的效应分子和第二信使表达调控发生异常，而方药伊木萨克片可纠正或调节上述功能途径发挥药理作用[3-7]。结合以往的研究，我们认为上述改变与药物的调控中，miRNA可能发挥着重要的作用，但其具体机制不详。

本研究在上述工作基础上，通过高通量测序技术，并进行综合分析，在阴茎组织中，筛查并确定了证候相关候选miRNA标志物15个，药物靶点候选miRNA标志物3个，而15个候选证候标志物中miR-486和miR-140-3p 两个指标被药物反向调控，我们推测该证候及其组织病变可能与体内miRNA表达和调控水平改变关系密切，方药可能通过影响证候相关的microRNA表达调控异常改变而发挥作用。

验证结果显示，miR-486在证候模型组显著上调（P＜0.05），药物干预后出现逆转变化（P＜0.05），与测序结果完全一致。生物信息学分析结果显示，miR-486主要涉及细胞的代谢过程的正性调控、程序性细胞死亡等功能；主要参与抗利尿激素调节的水分重吸收作用、肌动蛋白细胞骨架调节、缝隙连接、神经营养因子信号等通路。10号染色体缺失张力蛋白同源磷酸酶基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）是miR-486的预测靶基因[8,9]，该蛋白质通过负调控PI3K/Akt通路调节糖代谢和脂代谢[10,11]。推测，miR-486可能通过调控该信号通路影响异常黏液质证候的发生发展，并可被伊木萨克片干预所调控，但上述推测尚需基于进一步的功能研究来证实。

miR-140-3p验证结果为，在证候模型组中虽为上调，但是差异无统计学意义（P＞0.05），经药物干预后出现逆转性下调（P＜0.05）。miR-140-3p主要涉及调控细胞代谢过程蛋白质代谢过程、G蛋白偶联受体信号通路、细胞内的信号转导。主要参与Wnt信号通路、TGF-β信号通路、促性腺激素信号通路、丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶信号通路等；结合预测的靶基因功能分析，发现转化生长因子-β3（transforming growth factor beta 3，TGF-β3）是miR-140-3p的预测靶基因，TGF-β3具有抑制纤维化的作用[12,13]。miR-140-3p在药物干预后下调，可能通过上调TGF-β3，拮抗TGF-β/Smad3激活所致纤维化，而减轻阴茎组织纤维化，改善勃起功能。该结果从转录水平上阐释了本团队前期工作中发现的异常黏液质证候与阳痿病证大鼠模型血清睾酮含量降低、阴茎组织平滑肌/胶原纤维比例降低、组织间隙水肿、勃起功能减退这一改变，揭示了维药伊木萨克片干预后上述改变得到显著调整这一作用的内在机制[14]，提示miR-140-3p可作为药物靶点的标记物。

综上所述，本研究通过Illumina HiSeq 2000测序技术筛选并构建了异常黏液质证候与对证方药干预靶点大鼠模型阴茎组织候选标志物，并从中初步确定miR-486可作为证候标志物，miR-140-3p、miR-486作为药物靶点标志物，但仍需进一步做大样本量验证，并开展基于标志物在阴茎勃起功能障碍发生发展中可能发挥的作用与药物调控机制的进一步深入研究。

1 阿地力江•伊明, 范强, 潘建春, 等. 维医异常黏液质阳痿病证动物模型的建立. 中国男科学杂志 2011; 25(9): 3-9

2 阿地力江•伊明, 范强, 哈木拉提•吾甫尔, 等. 维医异常黏液质证候与阳痿病证大鼠性行为学改变的研究. 中国男科学杂志 2011; 25(9): 20-23, 28

3 张盼盼, 刘凤霞, 阿地力江•伊明, 等. 异常黏液质型阳痿病证大鼠性腺轴改变的形态学研究. 中国男科学杂志 2014; 28(7): 8-13

4 阿地力江•伊明, 潘建春, 哈木拉提•吾甫尔, 等. 维医异常黏液质证候与阳痿病证大鼠模型生殖激素的改变及其生物学意义. 新疆医科大学学报 2012; 35(11): 1438-1444

5 朱彦刘莹, 买买提祖农•买苏尔, 刘凤霞, 等. 伊木萨克片对异常黏液质型阳痿病证模型大鼠阴茎组织形态学的影响. 中国男科学杂志 2015; 29(6): 9-14

6 毛吾兰•买买提依明, 张盼盼, 刘凤霞, 等. 维医异常黏液质型阳痿病证大鼠模型阴茎组织中ET-1的改变及其生物学意义. 新疆医科大学学报 2016; 39(5): 535-537

7 刘凤霞, 腊博雅, 刘琪, 等. RhoA/Rho激酶在异常黏液质证候及阳痿病证大鼠阴茎中的表达及伊木萨克片干预的研究. 中国男科学杂志 2016; 30(9): 5-9

8 Small EM, O'Rourke JR, Moresi V, et al. Regulation of PI3-kinase/Akt signaling by muscle-enriched microRNA-486. Proc Natl Acad Sci U S A 2010; 107(9): 4218-4223

9 Hitachi K, Nakatani M, Tsuchida K. Myostatin signaling regulates Akt activity via the regulation of miR-486 expression. Int J Biochem Cell Biol 2014; 47: 93-103

10 曾静波, 李玉秀, 孙琦, 等. 罗格列酮和二甲双胍治疗对胰岛素抵抗KKAy糖尿病小鼠肝及横纹肌组织PTEN蛋白表达的影响. 中华老年多器官疾病杂志 2010; 9(6): 529-532

11 康英秀, 高鑫, 等. PTEN与胰岛素抵抗. 国际内分泌代谢杂志 2008; 28(2): 96-98

12 周霞, 徐可树. 转化生长因子-β3对肝脏和胰腺纤维化的影响. 世界华人消化杂志 2007; 15(28): 30-35

13 陈超, 武德梅. 转化生长因子-β3与肾脏纤维化的关系.医学综述 2014; 20(11): 24-25

14 买买提祖农•买苏尔, 朱彦刘莹, 刘凤霞, 等. 异常黏液质证候大鼠模型阴茎组织形态学改变的研究. 新疆医科大学学报 2015; 38(6): 687-695

（2016-12-28收稿）

Screening of microRNAs pro fi les in rats model of abnormal phlegmatic syndrome and its medication disproof and bioinformatics analysis*

Musa•Aimaier1△, Jiang Ping2△, MaoWulan•Maimaitiyiming3,
Ma Wenjing4, Meiheriguli•Sataer1, Siyiti•Amuti1,Wang Tianyu, Adilijiang•Yiming1**
1.Department of Human Anatomy, College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China;
2.Department of Physiology, College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University ; 3.Department of Biology, College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University; 4.Central Laboratory, Xinjiang Medical University Corresponding author: Adilijiang•Yiming, E-mail: adljym@126.com

Objective To select the differently expressed microRNAs(miRNA) on abnormal Phlegmatic syndrome and it’s medicine intervention rats's penile tissue, validate miR-486 and miR-140-3p, discuss the signi fi cance of biology of miR-486 and miR-140-3p.Methods Eighty healthy mature male SD rats were enrolled in this study, 10 of them were taken randomly as the control group, the other rats(70) were in the model group. Animal models of abnormal phlegmatic syndrome were established by treated with spinach and coriander diet in the cold humid environment. Biological characterization of rats were observed weekly until the models were successfully established. The rats were randomly divided into abnormal phlegmatic syndrome model group and abnormal phlegmatic syndrome model's medicine interventiongroup. Counterevidence was performed for 3 weeks, then penis tissue of the rats was collected to extract total RNA, and then subjected to Illumina Hiseq technology for screening differentially expressed miRNA, and then cluster analysis was performed, the candidate miRNA was selected and validated by qPCR.Results Total of 15 differentially expressed miRNAs related to Phlegmatic syndrome were identi fi ed , including 13 up-regulated miRNAs and 2 down-regulated miRNA; Three downregulation miRNAs related to target of medicine intervention were inversely regulated by Yimusake tablets treatment. The results of RT-qPCR showed that compare to control group, miR-486 was up-regulated in abnormal phlegmatic syndrome model group(P<0.05), miR-486 and miR-140-3p were down-regulated in abnormal phlegmatic syndrome model's medicine intervention group as compared to the abnormal phlegmatic syndrome model group(P<0.05).Conclusion miR-486 may be associated with the development of abnormal Phlegmatic syndrome. miR-140-3p, miR-486 may be as targets of Yimusake intervention.

abnormal phlegmatic syndrome; MicroRNAs; Yimusake tablets; computational biology

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.01.001

R 698.1

资助： 新疆维吾尔自治区自然科学基金联合基金项目（NO.2016D01C176）；中国博士后科学基金第58批面上资助-西部地区博士后人才资助计划(2015M582773XB)**

，E-mail: adljym@126.com△共同第一作者