华东地区两种植被带内天女花的遗传结构

徐延年,邵剑文,2,*

1 安徽师范大学生命科学学院,芜湖 241000 2 安徽省重要生物资源保护与利用研究重点实验室,芜湖 241000



华东地区两种植被带内天女花的遗传结构

徐延年1,邵剑文1,2,*

1 安徽师范大学生命科学学院,芜湖 241000 2 安徽省重要生物资源保护与利用研究重点实验室,芜湖 241000

天女花是一种名贵的珍稀观赏树种,现已被列为国家Ⅲ级保护植物,其自然分布区的植被类型可大致分为温带落叶阔叶林带(长江以北)和暖温带常绿阔叶林带(长江以南)。华东地区是天女花分布比较集中的区域之一,也是两种植被带的分界区。论文采用微卫星标记对华东地区两种植被带内的8个天女花自然种群的遗传多样性和遗传结构进行了分析。结果表明：华东地区天女花种群遗传多样性与近缘种相比较低(NA=3.83、HO=0.25、HE=0.40)；大别山(落叶阔叶林带)种群的遗传多样性(均值为HO=0.18和HE=0.28)明显低于皖南种群(常绿阔叶林带)的(均值为HO=0.33和HE=0.51),并且两者已发生了明显的遗传分化；两种植被带内的种群特征(如种群大小、胸径或丛枝数)差异不显著,种群内年幼亚群体的遗传多样与年老亚群体相比没有发生显著的变化。因此,推测大别山天女花种群经历的种群历史较短(较皖南种群)是导致其遗传多样性较低的主要原因,建议两种植被带内的天女花种群应视为不同的进化单元进行保护,当前仍应以就地保护为主。

天女花；遗传多样性；遗传结构；植被带；保护建议

木兰科植物由于具有较高材用、食用、药用及观赏和科研价值(古老的木本植物),且超过半数的类群已处于濒临灭绝的状态,现已引起了植物学研究者的广泛关注[1- 5]。天女花(Oyamasieboldii(K.Koch)N.H. Xia & C.Y.Wu)又名小花木兰、天女木兰,属落叶小乔木,该植物零星分布于我国东北和华东地区(日本和朝鲜也有少量分布),是典型的第三纪孑遗植物。其叶肥厚,花大,色白香浓,提取物可作为化妆品、香料以及药品的原料,具有较高经济利用价值,也是东亚特有的名贵珍稀观赏树种[6]。但近年来由于气候变化,人为砍伐和过渡采挖,再加上其自身的原因,天女花分布区正逐步缩小,种群及个体数量锐减,现已被列为国家Ⅲ级保护植物(国务院环境保护委员会,中国珍稀濒危植物名录(第一批),1984)。现有关天女花的研究工作主要是针对其种群群落结构、种子萌发特性、生殖对策以及快繁技术等开展的[7- 17],有关其种群的遗传多样性和遗传结构研究至今未见报道。

植被是指某一地区内全部植物群落的总称,是栖息地景观中最重要的特征之一,它为该地区的植物、动物和微生物的生存提供了必要的物质基础和环境[18],对区域内的动植物遗传特征有着重要的影响[19- 21]。天女花现有野生种群分布区的植被大致可以分为两类,即长江以北的温带落叶阔叶林带和长江以南的暖温带常绿阔叶林带[22]。两种植被带内的天女花种群遗传多样性及遗传结构是否有差异？如果有差异,导致差异形成可能的因素是什么？弄清这些问题对该珍稀濒危植物遗传管理和有效保护措施的制订具有指导意义[23-24]。

因此,本文拟对两种植被带分界线两侧,即大别山区(温带落叶阔叶林的代表)和皖南山区(包括江西三清山种群,暖温带常绿阔叶林带的代表)各4个种群的种群特征(种群大小、平均胸径及丛枝数)进行调查研究,并通过8对高多态性的微卫星引物分析它们的遗传多样性及遗传结构特征,以期为天女花科学保护措施的制订提供指导。

1 材料和方法

1.1 样品采集及种群特征的调查

图1 天女花8个采样种群的地理分布图 Fig.1 The locations of the 8 sampled populations of O. sieboldii

在查阅馆藏标本的基础上,于2013年6月对华东地区天女花可能的分布地点进行了调查和样品采集,共采集到8个自然种群(图1和表1),其中大别山山区4个和皖南山区4个(包括江西三清山种群),共223个植株,取幼嫩叶片硅胶干燥备用。对采样植株的地上丛枝数和最粗枝的胸径进行统计测量,并估测和统计种群大小(植株数)。

1.2 总DNA提取和PCR反应

总DNA提取参照改良的CTAB法[25]进行,提取的产物在1%的琼脂糖中电泳检测DNA的质量。从近缘种中[4, 26]筛选出8对高多态性且扩增稳定的微卫星引物用于本实验,并对上游引物5′末端进行荧光修饰(FAM、HEX或TAMRA,表2)。PCR扩增反应在Bio-Rad iCycler PCR仪上进行,反应总体积为15μL,包括: 5 ng DNA模板,1.5μL Buffer,2 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP,0.4 U Taq聚合酶,0.4μmol/L引物。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s,50—58℃退火30 s(表2),72℃延伸30 s,25个循环；95℃变性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸30 s,10个循环；72℃延伸15 min。PCR产物使用fluorescence-based基因电泳系统(ABI3730XL)进行数据自动化分析,用GeneScan 3.7分析软件(Applied Biosystems,USA)对微卫星基因型进行判读。

表1 取样的天女花种群信息

表2 微卫星位点及引物特征

1.3 数据分析

使用Genepop 4.0[27]软件检验引物是否存在连锁不平衡以及是否偏离Hardy-Weinberg平衡；使用Micro-Checker 2.2.3[28]软件检验各微卫星位点是否存在无效等位基因；使用GenAlEx 6[29]软件计算种群的等位基因数(NA)、观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)和近交系数(FIS)等遗传参数；使用Bottleneck软件检测各种群在近期是否经历了瓶颈效应；使用GENETIX[30]软件计算种群间的遗传分化系数(GST和FST)和基因流(Nm)；利用TFPGA[31]软件进行Mantel统计学检验种群间的地理距离与遗传分化程度的相关性。由于胸径和丛枝数与天女花生长的年限可能存在正相关性,为了检测各种群遗传特征的变化趋势,取胸径与丛枝数的中位数为界,把种群内的个体分为年幼和年老亚群体,再通过上述软件分别计算两亚群体的遗传参数。统计分析在SPSS11.0软件中进行,用单因素方差分析检验种群特征(胸径、丛枝数和种群大小)差异是否显著；分别用Mann-Whitney U test检验不同植被带内的遗传多样性参数差异显著性,用Wilcoxon signed-rank test检验年老和年幼亚群体的遗传多样性参数差异显著性。

在遗传结构上,用Arlequin 3.5[32]软件进行种群间和种群内的分子变异分析。使用Structure 2.2[33]中贝叶斯聚类法对所有个体进行聚类,K值设为9,10个重复,使用混合模型,burn-in设为100000和run-length设为1000000,参照Evanno等[34]计算ΔK值,分析可能的遗传结构；同时采用不基于遗传平衡原理的GenAlEx软件进行基于个体的主成分分析(PCoA)。采用2MOD 0.2[35]软件检测和计算各种群基因流和隔离漂变的相对强弱。

2 结果

经广泛查阅馆藏标本信息和调查,在温带落叶阔叶林植被带与暖温带常绿阔叶林植被带分界的长江两侧仅发现8个天女花自然种群(图1和表1),其中4个位于长江以北的大别山区,属温带落叶阔叶林植被带(以下简称大别山种群)；另4个位于长江以南,属暖温带常绿阔叶林植被带(以下简称皖南种群)。天女花自然种群植株数目差别较大,最小的为白马尖种群(BMJ,仅23个植株)；最大的为黄山(HS)和鹞落坪(YLP)种群,植株数约500株,它们的胸径也比较粗,平均值分别为4.37cm和4.89cm,明显大于其它种群(F7，212=9.652,P<0.001)；各种群的丛枝数平均值从3.73—6.36不等,但种群间差异不显著(F7，212=1.993,P=0.057)。两种植被带内的种群大小、胸径及丛枝数差异均不显(P0.05)。

从日本厚朴(Houpo⊇aobovata(Thunberg) N. H. Xia & C. Y. Wu)和星花玉兰(Yulaniastellata(Maximowicz) N. H. Xia)筛选出在天女花中能稳定扩增并具有多态性的引物共8对。它们对223个个体扩增共检测到105个等位基因,每个位点平均约13个基因(表2),其中M6D4引物等位基因数最多(达20个),M6D1引物最少(仅8个)。Micro-Checker和Genpop软件在这些微卫星位点中仅检测出少量位点在个别种群中可能存在无效等位基因和连锁现象,未见任何位点在3个以上的种群中出现无效等位基因或与其他位点连锁。因此这8对微卫星引物可以用于天女花种群的遗传多样性和遗传结构的分析研究。

表3 8个天女花种群的遗传多样性参数、瓶颈效应及2MOD的分析结果

NA: 等位基因数(Number of different alleles)；HO: 观测杂合度(Observed heterozygosity)；HE: 期望杂合度(Expected heterozygosity)；FIS: 近交系数(Inbreeding coefficient)； MD: 胸径均值(The mean diameter at breast height)；MB: 平均丛枝数(The mean branches)；TPM: 两相突变模型(Two-phase mutation model)；SMM: 逐步突变模型(Stepwise mutation model);L-shaped: 种群没有出现瓶颈效应(L-shaped distribution of alleles is expected in the absence of a bottleneck);种群编号见表1

8个天女花自然种群的平均等位基因数(NA)为3.83,观测杂合度(HO)为0.25,期望杂合度(HE)为0.40,YLP和HS种群的遗传多样性较高(HE分别为0.43和0.62,HO为0.23和0.38),BMJ和TZS种群的遗传多样性较低(HE分别为0.19和0.20,HO为0.18和0.14)。大别山区(即落叶阔叶林带)种群的遗传多样性参数(NA,HO和HE)均显著低于皖南山区(见表4)。8个种群作为总体和两种植被带分别检验种群的遗传多样性与种群特征(如大小、胸径及丛枝数)的相关性,仅发现皖南种群的期望杂合度(HE)与种群大小有明显的正相关性(r=0.982,P=0.018),其它相关性均不显著(P0.05)；种群内部根据胸径或丛枝数分为年老和年幼亚群体的遗传多样性参数(NA,HO和HE)及近交系数(FIS)也不存在显著的差异(图2)。种群近交系数(FIS)从0.06—0.50不等,均明显偏离哈-温平衡(95%的置信区间已明显大于0)。各种群均未检测到明显的瓶颈效应(表4),总体而言天女花采样种群的基因流模型和漂变模型大致相当(2MOD值平均为0.52,表4),但大别山种群更倾向于基因流模型(0.66),而皖南种群漂变模型更明显(0.38)。

表4 大别山种群与皖南种群的遗传多样性参数均值及其统计分析结果

图2 天女花种群的年幼和年老亚群体遗传多样性差异比较Fig.2 The comparation of the genetic diversity between young and old sub-populations within populations of O. sieboldii

华东地区天女花种群间的遗传分化系数GST均值为0.315(表5),其中最大值出现在TZS和GNJ种群间(GST=0.546),最小值出现在TZS和YLP种群间(GST=0.108)。大别山和皖南种群的平均遗传分化系数分别为0.198和0.269,两者间差异不显著性(T1，11=1.882,P=0.089)。总体上种群间的遗传分化程度与地理距离有正相关性(Mantel test:r=0.436,P=0.020),但两种植被带内这种正相关性并不明显(P0.05)。种群间的总体平均基因流Nm=0.340,大别山种群的平均基因流为Nm=0.632,高于皖南种群的Nm=0.352。

表5 8个天女花种群间的遗传分化系数(GST,对角线下)和地理距离(D,对角线上)/km

Table 5 Pairwise GSTvalues (below the diagonal) and geographical distances (above the diagonal) among the 8 sampled populations ofO.sieboldii

天堂寨鹞落坪白马尖天柱山牯牛降黄山清凉峰三清山TTZ323777201254315331YLP0．1761545168220283300BMJ0．3140．14648170218281304TZS0．2850．1080．157123176240255GNJ0．4850．4120．5410．54670134140HS0．3230．2710．3780．3830．29867137QLF0．3200．2540．3340．3100．2850．219151SQS0．3480．2840．4220．4080．3290．2330．249

AMOVA方差分析表明取样种群的主要遗传变异存在于种群间(占总变异的54.16%),而且不同植被带内天女花的遗传特征已发生了明显分化,它们之间的差异占总遗传差异的24.91%(P<0.001,表6)。主成分分析(图3)和STRUCTURE分析的结果(图4)也一致支持上述结果,不同植被带内的天女花种群均优先各自聚为一组。

表6 天女花分子变异的AMOVA分析结果

图3 天女花8个种群遗传结构的主成分分析结果Fig.3 Principal coordinates analysis (PCoA) for 8 sampled populations of O. sieboldii

图4 天女花8个种群的遗传结构STRUCTURE分析结果Fig 4 STRUCTURE analyses results of 8 sampled populations in O. sieboldiia:不同K值运算的lnP(D)平均值; b:依据Evanno等(2005)计算的ΔK值; C: K=2时的个体分配柱形图;种群编号同表1

3 讨论

木兰科植物是现存被子植物原始类群的重要代表[36],据化石记录起源于白垩纪亚尔必期[37]。它们大多数为高大乔木,是重要的森林和用材树种,而且多数具有较高的药用和观赏价值。由于气候变化、自身生物学特性及人为干扰和过渡采伐等原因,现全球超过半数的物种已处于濒临灭绝的状态[3, 5]。木兰科植物野生种质资源的保护与可持续利用是当前刻不容缓的重要课题[3]。由于是古老的木本植物且具异交的繁育系统,木兰科植物的种群遗传多样性相对较高,种群间分化较小[38],如日本厚朴(HO=0.88,HE=0.87)[39]、星花玉兰(HO=0.666,HE=0.719)[40]、MagnoliatomentosaThunb.(HO=0.650,HE=0.675)[41]等。然而本文研究的天女花华东地区的8个自然种群遗传多样性却较低(HO=0.25,HE=0.40),明显低于这些近缘种,也略低于天女花的日本亚种(O.sieboldiissp.japonicaK. Ueda,HO=0.360,HE=0.427)。但其种群间的遗传分化程度却较高(GST均值为0.315),主要的遗传变异存在于种群间(占总变异54.16%),明显高于它的近缘种厚朴(Houpo⊇aofficinalis(Rehder & E. H. Wilson) N. H. Xia & C. Y. Wu)、长蕊木兰(Alcimandracathcartii(J. D. Hooker & Thomson) Dandy)、星花玉兰等,也明显高于多年生植物的均值(0.19)和具异交繁育系统植物的均值(0.22)[42]。

物种的遗传多样性和遗传结构是其种群历史、繁育系统、基因突变、遗传漂变、基因流、自然选择等综合作用的结果[38]。对天女花而言,片断化岛屿状的生境、自交亲和的繁育系统及传粉昆虫缺乏可能是导致其遗传结构不同于近缘种(即种群内遗传多样性较低,种群间分化明显)的主要原因。天女花虽然分布较广,但间断分布明显,对生境要求比较高,喜凉爽、湿润的环境,多生于阴坡山谷。华东地区的天女花都局限分布于海拔1000米以上的阴坡山林,这些生境通常面积较小,呈典型的片断化岛屿状分布。而且这些生境内湿度大,气温较低,传粉昆虫通常缺乏,如于小丽等[43]和王立龙等[16]均研究发现天女花在自然状态下的结籽率很低(仅13%左右),人工补授花粉可以显著提高其结籽率。再加上天女花虽然雌蕊较雄蕊先熟,但人工控制授粉实验表明其自花授粉也能座果并产生饱满种子,说明它仍然保留着自交亲和的繁育系统,以适应传粉昆虫不足,保障生殖成功。这些因素综合导致了天女花种群间基因流小(Nm=0.340),不足以克服遗传漂变所带来的遗传负面效应,从而促使了种群的遗传多样性较低,种群间分化加剧[44]。

已有很多研究表明不同的生境或植被类型会对其区域内的动植物遗传多样性产生显著的影响[19, 45-46]。本文研究结果也表明天女花在两种植被带内种群的遗传多样性也存在显著差异,大别山区落叶阔叶林内的种群遗传多样性明显低于皖南常绿阔叶林内的种群(表4)。一般来说,种群较大和较强的基因流有利于保存较高的遗传多样性[20, 47-48],但华东地区不同植被带内的天女花种群大小、胸径及丛枝数并没有显著差异,基因流反而是大别山区种群间较强(可能是由于地理距离较近的原因),种群内年幼亚群体的遗传多样性也并不显著低于年老亚群体,因此种群大小、基因流及人为活动应该不是导致大别山天女花种群遗传多样性较低的主要原因。野外调查发现,虽然天女花种群在长江以南的常绿阔叶林植被带有分布,但其种群均在海拔1000m以上,小生境仍然是落叶阔叶林,因此天女花应是典型的落叶阔叶林树种,它的分布区与落叶阔叶林密切关联。然而,在第四纪盛冰期时,落叶阔叶林向南退缩到了北纬22°—30°附近,而北纬30°以北是针叶林或非森林植被[22, 49]。因此在末次盛冰期时,天女花种群可能全部退缩到了北纬30°以南,现北纬30°以北的种群应是由北纬30°以南的残存种群随着冰期后的气温回升向北逐步回迁而形成的。所以纬度越高,种群建立的历史相对越短,奠基者效应就越明显,种群遗传多样性也就越低,这可能是导致大别山区种群遗传多样性较低的主要原因,也可进一步推测华北地区的天女花种群遗传多样性可能更低(尚需进一步验证)。

物种保护的主要内容是保护其遗传多样性及进化潜力,种内遗传多样性越丰富,物种对环境变化的适应能力越强,其进化潜力也越大[50]。因此,物种遗传多样性及其遗传结构分析可以为珍稀濒危物种保护价值的评估以及保护策略的制订提供非常重要的信息[51]。对华东地区天女花遗传结构的研究分析表明,两种植被带内天女花的遗传多样性已发生了明显的分化,各自聚为一组(图3和图4)。虽然大别山种群的遗传多样性显著低于皖南种群,而且它极有可能是冰期后气温回暖过程中低纬度种群向北回迁而形成的,但由于生境选择或遗传漂变等原因,它现与皖南种群在遗传上已发生了明显分化,遗传特征并不包含在皖南种群内(图3和图4),因此建议大别山种群和皖南种群应视为独立的进化单元进行保护。与近缘种相比,虽然天女花种群的遗传多样性较低,种群间基因流较小,但考虑到它在两种植被带内的年幼亚群体与年老亚群体相比,遗传多样性均没有发生显著降低,预示着自然种群现处于基因流-隔离漂变平衡中[35]。再加上野外观察还发现天女花自然种群年龄结构比较稳定,并存在一定数量的幼苗,种群自然更新能力尚可。因此建议当今仍应以就地保护为主,尤其注意对其适宜生境的保护,在条件允许的情况下,可以适当辅以相同植被带内种群间的人工授粉,以增加其自然结籽率,来增强其自然更新的能力。

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The genetic structure ofOyamasieboldii(K.Koch)N.H. Xia & C.Y.Wu within two vegetation zones in Eastern China

XU Yannian1,SHAO Jianwen1,2,*

1CollegeofLifeScience,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241000,China2TheKeyLaboratoryofConservationandEmploymentofBiologicalResourcesofAnhui,Wuhu241000,China

Oyamasieboldii(K.Koch)N.H. Xia & C.Y.Wu is a rare species and has been listed as the national Ⅲ grade protection plants in China. The species is naturaly distributed in two different zones of forest vegetation, i.e., temperate deciduous broad-leaved forest (North of the Yangtze River) and warm temperate evergreen broad-leaved forest (South of the Yangtze River). The east region of China is one of the concentrated distribution areas ofO.sieboldii, and also is the boundary zone of these two different vegetations. The genetic diversity and structure of eight wild populations ofO.sieboldii, within two different vegetations from Eastern China, were analyzed by microsatellite markers. The results indicated that the genetic diversity ofO.sieboldiiin this region was relatively low (meanNA=3.83,HO=0.25 andHE=0.40) and lower than its closely related species. The mean population size, diameter at breast height (DBH) and number of branch were not significantly different between populations from different vegetations. However, the genetic diversity of Dabieshan populations (meanHO=0.18 andHE=0.28), within the temperate deciduous broad-leaved forest, was significantly lower than that of the Southern Anhui populations (meanHO=0.33 andHE=0.51), within the temperate evergreen broad-leaved forest, and their genetic characters obviously differentiated from each other. The distinct population history might mainly explain the difference of genetic diversity between these two zones. The genetic diversity of young individuals was not significantly lower than that of the old individuals within each population. Therefore, we proposed that the populations in Dabieshan area and Southern Anhui area should be considered as two different evolutionary significant units for conservation, and aninsituconservation strategy should be taken as the main protecting measures at present, given that the regeneration ability of wild populations was normal and the genetic diversity of young individuals did not significantly decreased.

Oyamasieboldii；genetic diversity；genetic structure；vegetation zone；conservation strategy

10.5846/stxb201601030009

国家自然科学基金面上项目(31170317);生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室资助项目

2016- 01- 03; 网络出版日期:2016- 08- 30

徐延年,邵剑文.华东地区两种植被带内天女花的遗传结构.生态学报,2017,37(7):2253- 2262.

Xu Y N,Shao J W.The genetic structure ofOyamasieboldii(K.Koch)N.H. Xia & C.Y.Wu within two vegetation zones in Eastern China.Acta Ecologica Sinica,2017,37(7):2253- 2262.

*通讯作者Corresponding author.E-mail: shaojw@mail.ahnu.edu.cn