日本七鳃鳗Lj-RGD3毒素肽的3种单RGD模体突变体的克隆表达及其抑制Lewis细胞活性研究

郑媛媛， 肖 蓉， 王继红， 李庆伟

(辽宁师范大学 生命科学学院,辽宁 大连 116081)



日本七鳃鳗Lj-RGD3毒素肽的3种单RGD模体突变体的克隆表达及其抑制Lewis细胞活性研究

郑媛媛， 肖 蓉， 王继红， 李庆伟

(辽宁师范大学 生命科学学院,辽宁 大连 116081)

为了评价Lj-RGD3 3个不同位点RGD模体的存在是否对该蛋白功能具有必要性及影响程度,采用全序列合成的方法合成了3种基于Lj-RGD3的RGD缺失突变体基因，并成功对其进行了pET23b载体的构建及重组蛋白的表达和纯化.将这3种分别保留第1位、第2位、第3位RGD模体的重组蛋白各命名为rLj-113、rLj-114和rLj-115.比较了这3种重组蛋白对Lewis小鼠肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响，并对其是否能引起Lewis肺癌细胞凋亡进行了测定.结果显示，rLj-113、rLj-114和rLj-115对Lewis的增殖半抑制浓度IC50值分别为2.73，2.75，2.53 μmol/L，并且以剂量依赖的方式抑制Lewis小鼠肺癌细胞的增殖；突变体蛋白还能抑制以bFGF(basic fibroblast growth factor)为趋化剂的Lewis 小鼠肺癌细胞的迁移及侵袭.综上可知，rLj-RGD3 蛋白的RGD模体的位置并不影响其在抗Lewis小鼠肺癌细胞的生物活性,而保留单RGD模体的突变体rLj-113、rLj-114、rLj-115仍然具有抑制Lewis小鼠肺癌细胞增殖、迁移、侵袭以及诱导Lewis细胞凋亡的生物学活性.

日本七鳃鳗;RGD 毒素蛋白;突变体;细胞黏附;迁移及侵袭

整合素是一类存在于细胞表面的异二聚体跨膜蛋白，由1个α亚基和1个β亚基组成，结构和种类的多样性使其能够识别多种配体，并影响相关的生物学功能.迄今已报道的整合素有24种，包括18种α亚基和8种β亚基[1].研究发现整合素在多种肿瘤细胞表面具有高表达的特点，整合素与ECM的结合在肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭中发挥重要的作用[2].拮抗整合素与其ECM表面配体的结合则会抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，甚至还能促进肿瘤细胞的凋亡[3].整合素配体拮抗剂类的抗肿瘤药物也成为一个热点的研究方向.

RGD(Arg-Gly-Asp)是细胞外基质蛋白特异性与细胞表面整合素识别并靶向结合的模体，因此RGD模体具有多方面的应用.例如，借助RGD对肿瘤细胞表面高表达的整合素的高特异性和高亲和性进行肿瘤的靶向识别，对化疗药物或是其他治疗癌症的药物进行含RGD标记或改造，使带有RGD模体的药物通过靶向识别肿瘤细胞，对肿瘤部位进行靶向药物运输[4],达到治疗癌症的目的.还有针对病灶部位进行影响成像[5]，达到直观判断病灶部位恶性程度的目的.除上述2种应用外,还有利用外源RGD作为肿瘤细胞与细胞外基质结合的竞争性拮抗剂，从而对肿瘤细胞的增殖及转移具有直接的抑制作用.RGD毒素蛋白就是这样一类外源性RGD物质.来源于蛇毒的去整合素(Disintegrin)为经典的整合素拮抗剂类RGD毒素蛋白.此外，发现于水蛭的水蛭素，发现于蜱类、牛虻唾液腺分泌物的RGD蛋白都属于这类RGD毒素蛋白[6-9].Lj-RGD3是本课题组于日本七鳃鳗口腔腺中发现的RGD类毒素蛋白，其具有3个RGD模体.前期的大量实验数据已经表明，Lj-RGD3在抗肿瘤细胞及抗血管新生方面具有强效功能，且呈剂量依赖方式.然而，Lj-RGD3具有3个RGD模体，这3个模体的存在对于Lj-RGD3蛋白的功能行使是否都是必不可少的引起了人们的兴趣.因此，本文对Lj-RGD3进行了只保留1个不同位置RGD模体的突变体构建及表达，并对这些突变体作用于Lewis小鼠肺癌细胞的抗肿瘤生物活性进行了比较.

1 材料与方法

1.1 材 料

小鼠肺癌细胞Lewis、克隆菌E.coliBL21为本实验室保存；TAKARA质粒提取试剂盒、IPTG购于大连宝生物公司；Novagen组氨酸亲和层析柱(His-bind column)；Gbico胎牛血清；PEPROTECHINC碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)；Beyotime细胞裂解液；BD公司的Annexin Ⅴ/PI细胞双染试剂盒；Costar Transwell 板.

1.2 目的基因的合成和转化

1.2.1 目的基因的设计与合成 根据野生型RGD3基因的氨基酸序列设计了3种突变体蛋白的氨基酸序列，通过全基因序列合成方法合成了突变基因，合成后的基因以NdeⅠ和Hind Ⅲ为酶切位点构建至pET23b载体(大连宝生物公司合成并构建).

1.2.2 重组质粒的转化 提取得到突变体阳性克隆质粒pET23b-113、pET23b-114、pET23b-115,通过琼脂糖电泳和基因测序鉴定为目的基因，将目的质粒通过CaCl2法转化至表达菌大肠杆菌E.coliBL21中.

1.3 蛋白的诱导表达及纯化鉴定

转化后的阳性菌于对数期加入IPTG后30 ℃过夜诱导表达，收集菌体后超声破碎，离心收集上清，用Novagen公司的组氨酸亲和层析柱纯化，Tricine-SDS-PAGE电泳进行蛋白质纯度鉴定和分子量的比较[10].

1.4 突变体蛋白rLj-113、rLj-114、rLj-115之间的部分生物学活性的比较

1.4.1 MTT法[11]检测比较对细胞增殖的影响 小鼠肺癌细胞Lewis接种在96孔板中，加入终质量浓度为3 ng/L的bFGF诱导细胞增殖过夜后，加入梯度浓度的突变体蛋白rLj-113、rLj-114、rLj-115后，培养24 h加入MTT，继续培养4 h后小心吸出上清液体，加入等量DMSO，490 nm下测光吸收值.1.4.2 细胞迁移实验 Costar的Transwell板(8.0 μm)下室中加入完全培养基和bFGF(作为趋化剂)，上室中加入无血清培养液细胞悬液，加入不同突变体蛋白6 h后取下多聚碳酸盐膜，用棉签擦拭掉内侧未迁移的细胞，显微镜下观察，每个样品随机选取5个视野拍照并计数，对实验结果进行科学统计[12].

1.4.3 细胞侵袭实验 将人工基质膜Marigel铺在Transwell板上的多聚碳酸盐膜上，模拟体内的细胞基质环境，其余与迁移实验基本相同，以bFGF做趋化剂，加入突变体蛋白16 h后取下多聚碳酸盐膜，棉签擦拭掉内侧的Marigel和未侵袭的细胞，显微镜下观察，每个样品随机选取5个视野拍照并计数，对实验结果进行科学统计.

1.4.4 Hoechst33258染色[13]和Annexin Ⅴ/PI双染[14]检测对细胞凋亡影响 Lewis细胞接种于玻片上培养过夜，加入PBS和突变体蛋白刺激过夜，用碧云天的Hoechst33258细胞凋亡试剂盒对突变体蛋白处理后的Lewis细胞进行固定及染色，镜下观察并拍照.细胞经刺激后，用不含EDTA的胰酶消化为悬浮细胞，悬浮后按照Annexin Ⅴ/PI试剂盒实验方法，加入FITC-Annexin Ⅴ 10 μL和PI 5 μL染色，室温下避光静置15 min后,1 h内流式细胞仪测定结果.

1.5 统计学分析

应用SPSS13.0 统计软件，采用方差分析对结果进行统计分析.

2 结 果

2.1 对RGD3氨基酸序列的分析和突变体设计

本实验室前期工作表明Lj-RGD3具有抗血小板、抗肿瘤功能，并包含3个RGD模体，野生型Lj-RGD3氨基酸序列如图(图1A)/.本次为研究3个不同位置上RGD模体的功能，将RGD3突变为3个突变体，分别是rLj-113、rLj-114和rLj-115，设计方案如图(图1B).

图1 Lj-RGD3的氨基酸序列和突变体设计示意图A.Lj-RGD3的氨基酸序列;B.原理图设计用突变体.rLj-113保留第1个RGD模体.rLj-114保留第2个RGD模体.rLj-115保留最后1个RGD模体Fig.1 The deduced amino acid sequence of Lj-RGD3 toxin protein and mutants for schematic designA.The deduced amino acid sequences of Lj-RGD3;B.Mutants for schematic design.rLj-113 remained the first RGD motif.rLj-114 remained the second RGD motif.rLj-115 remained the last RGD motif

2.2 质粒提取与转化

使用TAKARA质粒提取试剂盒从3种突变体阳性克隆菌E.coliJM109中提取出含有目的基因的质粒pET23b-113、pET23b-114、pET-23b-115以及实验室保存的E.coliBL21提取的质粒pET-23b-RGD3，通过琼脂糖凝胶电泳对提取质粒的质量进行鉴定(图2).并通过测序鉴定确实为设计方案预期的氨基酸组成.

2.3 突变体蛋白rLj-113、rLj-114、rLj-115的表达和纯化

将转化成功的E.coliBL21培养至对数期后加入IPTG于30 ℃诱导过夜，超声破碎菌体离心后收集上清，用组氨酸亲和层析柱纯化目的蛋白.结果显示，rLj-113、rLj-114和rLj-115在此条件下成功可溶性表达，Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定如图(图2B)，纯度在95%以上，分子量在14 kDa左右.由于3种蛋白是碱性蛋白，其电泳位置要比实际位置偏大.

图2 突变质粒的琼脂糖凝胶电泳和亲和层析得到的突变体蛋白的小分子SDS电泳A.琼脂糖凝胶电泳:1.Marker；2～4质粒pET23b-113、pET23b-114 和 pET23b-115;B.rLj-113、rLj-114 和 rLj-115分子量相同:1.Marker；2～4是纯化的rLj-113、rLj-114和 rLj-115蛋白Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the mutations and Tricine SDS-PAGE of the mutant proteins purified by affinity chromatography A．Agarose gel electrophoresis of the mutations:1 lane was the Maker;2～4 lanes were pET23b-113,pET23b-114 and pET23b-115;B.The molecular weight of rLj-113,rLj-114 and rLj-115 is same:1 lane was Marker;2～4 lanes were the purified rLj-113,rLj-114 and rLj-115 protein

2.4 突变体蛋白rLj-113、rLj-114、rLj-115对小鼠肺癌细胞Lewis生物活性影响的比较

2.4.1 突变体蛋白对bFGF诱导的小鼠肺癌细胞Lewis增殖的影响 MTT 法测定结果显示，rLj-113、rLj-114和rLj-115对Lewis细胞增殖均有抑制作用(图3).半剂量效应量(half maximal inhibitory concentration，IC50) 分别为2.73，2.75，2.53 μmol/L．

图3 用不同浓度突变体蛋白处理24 h对Lewis细胞生长的抑制(MTT测定)A.对rLj-113的IC50值是2.73 μmol/L;B.对rLj-114的IC50值是2.75 μmol/L；C.对rLj-115的IC50值是2.53 μmol/LFig.3 Growth inhibition in Lewis cell lines treated with mutants at the indicated concentrations for 24 h (MTT assay)A.The IC50 of rLj-113 for inhibition is 2.73 μmol/L;B.The IC50 of rLj-114 for inhibition is 2.75 μmol/L;C.The IC50 of rLj-115 for inhibition is 2.53 μmol/L

2.4.2 突变体蛋白对bFGF 诱导的小鼠肺癌细胞Lewis迁移和侵袭的抑制作用 恶性肿瘤具有扩散的特点，依赖于肿瘤细胞的迁移和侵袭.作为抑制肿瘤效果的一个指标，本文比较了rLj-113、rLj-114和rLj-115对Lewis细胞迁移和浸润的影响.结果显示，rLj-113、rLj-114和rLj-115对Lewis细胞的迁移和侵袭都具有抑制作用，而且相同作用浓度时抑制效果相似(图4).

图4 Transwell法测定Lewis细胞的迁移和侵袭A.显微镜下迁移和侵袭的细胞(×200);B.rLj-113、rLj-114和rLj-115对Lewis细胞迁移和侵袭的抑制率Fig.4 Migration and invasion of Lewis cells measured by Transwell assayA.Migrated and invaded cells were imaged by microscopy(×200)； B.The inhibition rate of rLj-113, rLj-114 and rLj-115 on Lewis cells migration and invasion

2.4.3 突变体蛋白对bFGF 诱导的小鼠肺癌细胞Lewis凋亡的影响 正常细胞经Hoechst33258染色液染色后，荧光显微镜下观察细胞核呈弥散均匀黯淡荧光，凋亡细胞的细胞核或细胞质内可见致密浓染的颗粒状荧光.结果显示，突变体rLj-113、rLj-114、rLj-115在作用浓度为2.5 μmol/L能有效诱导Lewis细胞发生凋亡(图5A).细胞发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸(PS)由正常细胞状态下的细胞内测翻转到膜外侧. 荧光标记的Annexin Ⅴ特异性结合PS. PI标记凋亡晚期凋亡细胞. 实验结果显示，rLj-113、rLj-114、rLj-115能够有效诱导Lewis发生凋亡(图5B).

图5 比较突变体蛋白对Lewis细胞凋亡的影响A.PBS和突变体蛋白(rLj-113、rLj-114、rLj-115)处理后的细胞用Hoechst33258染色;B.Annexin Ⅴ/PI染色凋亡分析Fig.5 Comparison on the effect of the apoptosis for the mutant proteins in LewisA.Lewis cells were treated with PBS or the mutant proteins (rLj-113、rLj-114、rLj-115) and stained with Hoechst33258;B.The Annexin Ⅴ/PI staining apoptosis assay

3 讨 论

野生型Lj-RGD3是本实验室从日本七鳃鳗口腔腺中提取RNA，经cDNA反转录得到的具有3个RGD模体的毒素蛋白.竞争结合细胞表面整合素，封闭整合素相关信号通路，进而影响整合素相关的肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并且对正常的细胞影响效果不明显.本文为了研究其3个不同位置的RGD的区别，对3种突变体的设计和一些生物学活性进行了比较.实验表明，3种突变体对小鼠肺癌细胞Lewis增殖抑制的IC50分别为2.73，2.75,2.53 μmol/L，作用效果不相上下.而其在半抑制浓度左右时，对小鼠肺癌细胞Lewis的迁移和侵袭的抑制率均在30%～40%左右，稍有不同，但无明显差异.通过Hoechst染色观察和Annexin V/PI双染的流式细胞术检测可以证明，3种突变体rLj-113、rLj-114和rLj-115均能促进这种肿瘤细胞的凋亡.由此可见，不同位置的RGD模体的变化并不影响其抑制肿瘤细胞的作用.

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Molecular cloning and activity of recombinant proteins,rLj-113,rLj-114 and rLj-115,mutants contain only one RGD motif respectively transformed from Lj-RGD3 protein

ZHENGYuanyuan,XIAORong,WangJihong,LIQingwei

(School of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China)

To explore whether the three RGD motifs on different positions have different effects on these functions,we got three mutant genes named rLj-113,rLj-114,rLj-115 through the method of full sequence synthesis based on the RGD3 genes.We successfully expressed and purified the mutant proteins.We comparied biological activity about integrins associated proliferation,migration,invasion of these three recombinant proteins on Lewis lung cancer cells.The results showed that the three mutants inhibited the proliferation of the Lewis cells in a dose-dependent manner,the IC50are 2.73，2.75，2.53 μmol/L.They can also inhibit integrin associated proliferation,migration and invasion on Lewis cells in a dose-dependent manner.In conclusion,the position of the RGD motif on Lj-RGD3 did not affect the biological activity on anti-tumor cells.rLj-113,rLj-114,rLj-115 mutants remained only one RGD motif had the activity on inhibiting Lewis cells.

Lamprey Janpanica;RGD toxin protein;mutant;cell adhesion;migration and invasion

2016-07-14

国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2014AA093502);国家自然科学基金资助项目(30471975);全国海洋公益资助项目(201305016-5)

郑媛媛(1990-),女，辽宁盘锦人，辽宁师范大学博士研究生; 李庆伟(1955-),男，辽宁大连人，辽宁师范大学教授，博士,博士生导师.

1000-1735(2017)02-0239-06

10.11679/lsxblk2017020239

Q789

A