不同形态无机氮对蛋白核小球藻生长及碳酸酐酶胞外酶活性的影响

李海涛 赵 铖

(贵州师范大学喀斯特研究院，贵阳 550001)



不同形态无机氮对蛋白核小球藻生长及碳酸酐酶胞外酶活性的影响

李海涛 赵 铖

(贵州师范大学喀斯特研究院，贵阳 550001)

为研究不同形态无机氮对湖泊富营养化的影响，本研究采用实验室内纯培养微藻来模拟不同浓度铵态氮、硝态氮对蛋白核小球藻生长及其对碳酸酐酶胞外酶活性的影响。研究发现：提高无机氮浓度有利于蛋白核小球藻的生长，且铵态氮更利于蛋白核小球藻的生长。碳酸酐酶胞外酶在补偿蛋白核小球藻的无机氮营养不足方面具有重要作用。

无机氮；微藻；碳酸酐酶

氮是组成蛋白质的基本元素，是生命活动所必须的元素，而且是合成生物体的大量元素之一，同时也是限制初级生产力的重要营养元素之一。在生物圈的物质流动与能量转化过程中，氮素都起着非常关键的作用。

过量氮、磷的排放是引起水体富营养化的元凶，近年来，以无磷洗涤剂等为代表的控磷措施已经得到有效推广，但是，由于农用化肥的大量施用，特别是含氮化肥的过量使用，造成农业面源污染强度加大，带来大量氮素进入水体，并对水体生态环境产生了一系列影响，如：长江、乌江、滇池等的水体富营养化问题，给人类生产、生活等带来了系列问题[1-3]。贵阳的“两湖一库”也存在不同程度的富营养化问题，并经历了从污染到治理，再到最后保护的艰难历程[4]。因此，系统的了解氮在河流、湖泊等自然水体微藻中的转化规律，在科学治理水体富营养化方面具有重要意义。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料及培养条件

藻种选用的是喀斯特湖泊水体中常见的微藻—蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。在实验室的人工温室中进行控制条件培养。

微藻培养条件如下，光照强度：150μmol·m-2·s-1；光暗周期：12h/12h；白天温度：25.0±1.0℃，夜间温度：22.0±1.0℃。通过添加少量NaOH或HCl调节初始pH值都在8.00±0.05，为使藻种保持旺盛的生长状态，不断进行继代培养。实验处理平行培养4瓶，且在实验处理过程中，不断随机调换位置，以消除培养室微环境差异对微藻生长的影响。

1.2 常规指标及测定方法

叶绿素含量的测定采用紫外分光光度法[9]。

1.3 碳酸酐酶活力测定

碳酸酐酶活力的测定参照Wilbur和Anderson的电化学法[10]，采用改进的锑微电极开路电路法[11]。具体操作如下：离心收集适量的蛋白核小球藻样品，用巴比妥钠缓冲液(pH=8.3，20.0mmol·L-1)悬浮微藻细胞并定容终体积。然后，使用电化学工作站，在0℃条件下，采用开路电位法监测该反应体系pH值的变化，同时采集电位变化过程曲线，最后用Origin软件将匀速变化的一段数据进行线性拟合。在测定样品的同时，保持实验条件稳定的条件下，交叉进行空白实验(以巴比妥钠缓冲液代替样品)。分别计算pH下降一个单位所需要的时间(T)。

胞外碳酸酐酶活力的计算公式：WAU=T0/T-1，T0代表空白所需要的时间，T代表样品所需要的时间，碳酸酐酶活力单位(以叶绿素a计)为WAU/mg Chl-a。

2 结果与讨论

2.1 无机氮对蛋白核小球藻生长的影响

无机氮浓度变化对蛋白核小球藻生长的影响明显，如图1所示，缺氮处理能够抑制蛋白核小球藻的生长，随着实验处理所添加的无机氮浓度的升高，蛋白核小球藻的生长整体呈不断增长的趋势。

从铵态氮和硝态氮对蛋白核小球藻生长的影响来看，铵态氮更利于蛋白核小球藻的生长，这跟铵态氮更利于植物吸收利用有关。

图1 不同无机氮处理下的蛋白核小球藻叶绿素含量变化

2.2 无机氮对蛋白核小球藻碳酸酐酶胞外酶活性的影响

碳酸酐酶胞外酶催化植物光合作用固定无机碳的速度[5]，从而间接加快蛋白核小球藻对无机氮的利用速率。由图2可以看出，低浓度无机氮水体环境有利于刺激蛋白核小球藻碳酸酐酶胞外酶活性的升高，植物通过调高碳酸酐酶胞外酶活性来弥补营养不足的逆境。在添加高浓度无机氮的条件下，蛋白核小球藻的碳酸酐酶胞外酶活性明显下降，而蛋白核小球藻的叶绿素含量并没有发生明显变化，由此可以认为，在无机氮营养充足的条件下，蛋白核小球藻不需要调高碳酸酐酶胞外酶活性也能维持自身生长的需要。总之，碳酸酐酶胞外酶在弥补蛋白核小球藻的无机氮营养不足方面具有重要作用。

图2 不同无机氮处理下的蛋白核小球藻胞外碳酸酐酶活性变化

结合不同无机氮处理下的蛋白核小球藻叶绿素含量和碳酸酐酶胞外酶活性的变化趋势，我们不难发现铵态氮更利于激发碳酸酐酶胞外酶活性(见图2)，由此可以更好的解释铵态氮处理下的蛋白核小球藻叶绿素含量更高的现象(见图1)。

3 结论

蛋白核小球藻的生长随无机氮浓度的升高整体呈不断增长的趋势，具体到不同形态的无机氮来说，铵态氮更利于蛋白核小球藻的生长。碳酸酐酶胞外酶在补偿蛋白核小球藻的无机氮营养不足方面具有重要作用，且铵态氮更利于激发碳酸酐酶胞外酶活性的升高。

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[4] 王长娥.贵州省红枫湖、百花湖和阿哈水库污染源的现状调查、分析与评价[D].贵阳：贵州师范大学，2009.

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[6] 李海涛，吴沿友，徐莹.胞外碳酸酐酶对湖泊微藻稳定碳同位素组成的影响[J].地球与环境，2014，42(02)：174-178.

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[8] 孔维宝，汪洋，杨红，等.不同营养方式对普通小球藻生长代谢及生化组分的影响[J].微生物学报，2015,55(3):299-310.

[9] 丛海兵,黄廷林,周真明,等.藻类叶绿素测试新方法[J].给水排水,2007,33(6)：28-32.

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[11] 施倩倩,吴沿友,朱咏莉,等.构树与桑树叶片的碳酸酐酶胞外酶活力比较[J].安徽农业科学,2010,38(16):8376-8377.

Effect of different forms of inorganic nitrogen on algae growth and extracellular carbonic anhydrase inChlorellapyrenoidosa

Li Haitao, Zhao Cheng

(School of Karst Science, Guizhou Normal University, Guiyang 550001)

In order to study the effect of different forms of inorganic nitrogen on lake eutrophication, in this study,Chlorellapyrenoidosawas cultured in a greenhouse by adding different concentrations of ammonium nitrogen or nitrate nitrogen in the medium. The growth rate and the extracellular carbonic anhydrase activity were collected under different concentrations or forms of inorganic nitrogen. From this study, we conclude that the growth of the inorganic nitrogen is conducive toChlorellapyrenoidosa, and ammonium nitrogen is more active than that of nitrate nitrogen. The extracellular carbonic anhydrase plays an important role in compensating inorganic nitrogen deficiency forChlorellapyrenoidosa.

inorganic nitrogen; microalgae; carbonic anhydrase

贵州省科学技术基金(黔科合J字[2014]2131号)

2017-04-05; 2017-05-10 修回

李海涛(1982-)，男，博士，研究方向：环境地球化学。E-mail: lisea02@126.com

P593，X524

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