海南南繁基地玉米茎腐病病原菌的分离及鉴定

牛艺诺， 林宝英， 刘全凤， 刘永震， 吴金山， 戎 伟， 梅双双*

(1.海南大学 热带农林学院， 海南 儋州 571737； 2.海南省食品检验检测中心， 海口 571001；3.沧州市农林科学院， 河北 沧州 061001； 4.沧州市植物保护检疫站， 河北 沧州 061000)

海南南繁基地玉米茎腐病病原菌的分离及鉴定

牛艺诺1， 林宝英2， 刘全凤3， 刘永震4， 吴金山1， 戎 伟1， 梅双双1*

(1.海南大学 热带农林学院， 海南 儋州 571737； 2.海南省食品检验检测中心， 海口 571001；3.沧州市农林科学院， 河北 沧州 061001； 4.沧州市植物保护检疫站， 河北 沧州 061000)

为明确海南地区南繁基地玉米茎腐病的病原，从玉米发病组织中分离病原菌，并进行了纯化培养、革兰氏染色、病原菌回接等试验，得到了2株对玉米有较强致病力的菌株，分别命名为JF02与JF04.随后通过PCR反应扩增了所分离的玉米茎腐病病原菌JF02与JF04的16S rRNA序列，并测序，序列分析表明，所分离的玉米茎腐病病原菌序列相同，属同一病原菌，且为狄克氏菌.该病原菌的分离和鉴定为玉米细菌性茎腐病的防治和抗性品种选育提供了一定的理论参考.

玉米茎腐病； 病原菌； 狄克氏菌

玉米是我国重要的粮食作物，栽培面积位居第一位.在玉米的生产过程中，玉米茎腐病是世界范围内普遍发生的一种严重病害，主要表现为玉米根部和茎基部腐烂，最后引起玉米倒伏或整株枯死，严重影响玉米的产量.根据病原菌的不同，玉米茎腐病分为玉米真菌性茎腐病和玉米细菌性茎腐病.玉米真菌性茎腐病，又称玉米青枯病，镰孢菌是该病的主要病原菌[1-3].玉米真菌性茎腐病是一种毁灭性土传病害，病原菌自根系侵入，在植株内蔓延扩展，最后病株根部，茎部出现空心、变软，遇风易倒伏，整个植株叶片自下而上失水变成青灰色并发生干枯，呈现青枯症状[4-5].玉米细菌性茎腐病是由胡萝卜欧文氏菌玉米专化型(Erwiniacarotovoraf.sp.zeae)引发的病害，该病原菌近期被命名为玉米狄克氏菌(Dickeyazeae)[6-8].玉米细菌性茎腐病症状主要表现为玉米中下部叶鞘和茎秆上出现不规则的水渍状病斑，发病组织软化、腐烂并散发出腥臭味，最后植株在发病部位折断，导致玉米不能抽穗和或结实[9-11].

海南省地处热带北缘，冬季温度高，适宜玉米种植.我国在海南三亚建立南繁基地，各农业部门、大专院校和科研院所冬季在三亚进行玉米品种选育、加代繁殖和杂交配置.在玉米种植的幼苗时期，玉米叶片为10多片叶时，玉米茎腐病是一种常见病害，高温高湿环境下，该病发生更为严重，引起玉米倒伏和整株植物发生死亡，对玉米的种植带来了严重的影响.但引发玉米茎腐病的病原菌目前仍是未知的.在本研究中，通过观察南繁基地玉米茎腐病发病症状、以及进行病原菌的分离和回接实验，证实南繁基地玉米茎腐病是细菌性茎腐病.另外，通过对病原菌16S rRNA序列分析，发现病原菌JF02和JF04实为玉米狄克氏菌.该研究为进一步防治南繁基地的玉米茎腐病工作提供了一定的理论参考.

1材料和方法

1.1材料

1) 菌体：大肠杆菌DH 5α，本实验室保存.病原菌JF02、JF04，本实验室分离.

2) 玉米自交系：玉米自交系昌7-2.

1.2试验方法

1.2.1病原菌的分离与纯化 将玉米茎腐病发病部位用无菌水和70%的酒精进行清洗，随后用无菌手术剪截取发病组织2～3 cm的小段，部分小段放入PDA培养基.部分小段放入无菌研钵中加无菌水研磨，直至无明显块状植物组织为止，将组织匀浆稀释10倍和100倍，取20 μL涂布在LB平板培养基上，培养1～2 d后，进一步通过划线得到单克隆病原菌[5].

1.2.2革兰氏染色 将分离纯化后的病原菌JF02培养至对数生长期后涂片固定，用草酸铵结晶紫染1 min，自来水冲洗，加革兰氏碘液覆盖涂面染约1 min，水洗，用吸水纸吸去水分，加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20 s后水洗，吸去水分.蕃红染色液(稀)染1 min，自来水冲洗.干燥，显微镜镜检.

1.2.3生理生化鉴定 生理生化鉴定采用环凯细菌生化鉴定管.将分离纯化后的病原菌JF02培养至对数生长期，按照说明书规定的接种方法，分别接种各生化鉴定管，28℃培养24～48 h，观察结果.

1.2.4病原菌回接 将分离纯化后的病原菌JF02 28℃培养过夜，4 000 rpm离心10 min，弃上清，用无菌去离子水悬浮菌体沉淀，调整菌液浓度至1×108CFU/mL，用牙签沾取菌液刺入玉米的茎部，同时用无菌水作对照，接种4～6 d后观察发病情况.

1.2.5病原菌16S rRNA序列的测定 提取病原菌JF02基因组DNA，利用16S rRNA序列全长通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，和1429R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)[12]，进行PCR扩增.将扩增片段进行回收，连入T载体进行测序[2].

2结果与分析

2.1病原菌分离及回接实验

从海南省南繁基地采集的玉米茎腐病病样组织(图1)中分离纯化培养出两株细菌，命名为JF02和JF04.将病原菌JF02和JF04活化后，在28℃培养过夜后，调整菌液浓度至108CFU，利用针刺的方法接种玉米感病品种昌7-2，并接种无菌水作为对照.接种5 d后，JF02和JF04玉米接种植株从发病部位均呈现倒折状态，对照接种水不发病.结果表明JF02和JF04是玉米细菌性茎腐病的病原菌.

图1 田间玉米发病组织Fig.1 Maize stalk rot disease in wild field

图2 病原菌JF02和JF04回接结果Fig.2 The bacteria strain JF02 and JF04 caused maize stalk rot disease

2.2病原菌16S rRNA 序列测定和分析

提取病原菌JF02和JF04全基因组DNA序列.利用细菌16S rRNA测定通用引物27F和1429R进行PCR扩增，回收扩增产物，进行测序.结果表明JF02和JF04菌株16S rRNA序列完全相同，表明二者可能来源于同一菌株.进一步通过Blast分析，发现二者序列与玉米狄克氏菌DickeyazeaeEC1同源性达到99%(图3)，结果表明玉米茎腐病病原菌为玉米狄克氏菌.

2.3病原菌JF02生理生化鉴定结果

经过革兰氏染色，镜检，发现该菌株是一种革兰氏染色阴性的球杆菌(图4)，无芽孢.经生理生化鉴定，该分离菌能够利用葡萄糖产酸，但不产气；能分解甘露醇产酸，不能利用乳糖、麦芽糖、蔗糖、山梨醇、侧金盏花醇；靛基质试验阴性，MR试验阴性，VP试验阳性，西蒙氏枸橼酸盐试验阴性，硫化氢试验阴性，尿素试验阴性，动力试验阳性，丙二酸盐试验阴性，苯丙氨酸试验阴性，鸟、赖氨酸脱羧酶试验阴性.根据以上实验结果初步将该分离菌鉴定为狄克氏菌属.

图3 JF02与Dickeya zeae EC1 16S rRNA比对结果Fig.3 The 16S rRNA difference between JF02 and Dickeya zeae EC1

图4 JF02是革兰氏阴性菌.Fig.4 JF02 is a gram-negative bacteria strain

3讨论

玉米细菌性茎腐病具有传染性强、高温高湿环境下易暴发流行等特点，对玉米产量影响巨大.近年来，随着玉米田病虫害种类的不断增多，玉米细菌性茎腐病的发生也呈现逐年加重趋势，20世纪80年代后期至90年代初期曾在我国严重发生.近年来，一些地区生产中反映该病害又有加重的趋势[11，13].为了更好地指导玉米生产，本实验室从海南省南繁基地爆发玉米茎腐病的地块中采集了玉米病变组织，进行了病原菌的分离，得到了两株细菌菌株，命名为JF02和JF04.16S rRNA的DNA序列进行测定和分析，发现二者序列完全相同，并且与玉米狄克氏菌同源性高达99%[14-15]，进一步确定该病原菌为玉米狄克氏菌.

文献报道，玉米茎腐病病原多是真菌，又称为青枯病，该病主要在我国北方发生.海南由于其特殊的地理位置，处于高温高湿的环境，植物病害的病原菌与中国内地地区可能存在较大差异，当前在国内尚未见报道海南地区玉米茎腐病的病原菌.通过本实验，发现玉米狄克氏菌是海南南繁基地玉米茎腐病的主要病原菌，这为进一步防治该病的发生，和未来的抗病育种以及分离抗玉米茎腐病基因提供了一定的理论指标.

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The isolation and identification of maize stalk rot pathogen in Hainan Southern Fan Base

NIU Yinuo1， LIN Baoying2， LIU Quanfeng3， LIU Yongzhen4，WU Jinshan1， RONG Wei1， MEI Shuangshuang1

(1.College of Tropical Agriculture and Forestry，Hainan University， Danzhou， Hainan 571737；2.Hainan Institute for Food Control， Haikou 571001；3.Cangzhou Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Cangzhou， Hebei 061001；4.Cangzhou Plant Protection and Quarantine Station，Cangzhou， Hebei 061000)

To identify the pathogen of maize bacterial stalk rot disease occurred in Southern Fan Base of Hainan Province，the pathogenic bacteria JF02 and JF04 were isolated from the maize stalk rot tissue. Back inoculation assay confirmed that JF02 and JF04 are the pathogen of maize stalk rot disease. In addition， the bacteria strain JF02 and JF04 display the same 16S rRNA sequence and is very closed toDickeyazeaeEC1 (99%)， which indicated that JF02 and JF04 are the same and belongs toDickeyazeae. Overall， this study provide references for the control of maize bacterial stalk rot disease and future screening of resistant maize inbred line．

Maize； stalk rot disease；Dickeyazeae

2017-02-28.

国家自然科学基金项目(31560296)；海南省自然科学基金项目(314057，314057)．

1000-1190(2017)03-0345-04

Q94

A

*通讯联系人. E-mail: mssrw2002@126.com．