转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花主要生化物质含量变化及其对棉田昆虫的影响

雒珺瑜, 张 帅, 朱香镇, 吕丽敏, 王春义, 崔金杰中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花主要生化物质含量变化及其对棉田昆虫的影响

雒珺瑜, 张 帅, 朱香镇, 吕丽敏, 王春义, 崔金杰*
中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000

【目的】新型转基因棉花在进入大规模商业化应用前，需对其生态环境安全性进行评价；同时，经基因改造的新型转基因抗虫棉花可能影响抗虫棉的次生代谢，进而导致一些综合的生态学效应，致使棉花生理上发生改变，这也是转基因植物安全性评价研究的重要内容。【方法】比较了不同关键时期新型转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花与转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比、主要酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)]活性、营养物质(蛋白质、氨态氮、脯氨酸和可溶性糖)和次生代谢产物(棉酚和单宁)含量的差异及其对棉田不同昆虫营养层昆虫个体总数和物种数的影响。【结果】棉花生长的蕾期、花期和花铃期，转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花、转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比呈先升高后降低的趋势；SOD和POD活性在花铃期明显升高，CAT、APX和GR活性无显著变化；蛋白质、氨态氮含量无明显变化，脯氨酸和可溶性糖含量均表现为先升高后下降的趋势；棉酚含量在3个时期无显著变化，而单宁含量呈逐渐升高的趋势。3种棉花叶片中干物质积累、主要酶活性、营养物质和次生代谢产物含量均无显著差异；单株大铃数表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花>转Cry1Ac基因棉花>非转基因棉花，小铃数则表现为转Cry1Ac基因棉花

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花； 生化物质含量； 昆虫个体总数； 物种数

转Bt基因抗虫棉是目前应用面积最大、使用时间最长的转基因植物(Romeisetal.,2008)，其有效控制了棉铃虫HelicoverpaarmigeraHübner、红铃虫Pectinophoragossypiella(Saunders)等鳞翅目主要害虫的暴发和危害，降低了棉田化学农药的使用量和使用次数，保护和增多了农田自然天敌昆虫的种类和数量，进而有效地保护了生态环境(马惠等,2009; 苏宏华等,2010; James,2009; Wu & Guo,2005)。但任何一种植物在生长发育过程中都会遭受多种害虫危害，一种抗虫基因不能抵御所有害虫，且基因的类型不同，其抗虫效果和靶标害虫也不相同。美洲棉铃虫、红铃虫已在田间对Bt棉产生了抗性(Alietal.,2006; Tabashniketal.,2010)，且棉铃虫对Bt棉抗性上升的风险在逐年加大(梁革梅等,2000; 徐广等,2002; Lubna,2014)。因此，很多抗性治理和延缓策略应运而生，其中，转2个或2个以上基因被认为是一种比较有效的延缓措施，不仅可进一步加强转基因植物的抗虫能力，拓宽其抗虫谱，而且有助于延缓害虫产生耐受性，从而延长转基因棉花的使用寿命(McGaugheyetal & Whalon,1992; Tabashniketal.,1997)。

棉花等植物在进化过程中，形成了一套有利于自身发育的基因体系和生理代谢途径，当外源Bt基因被导入其内部后，其自身固有的连锁群被打破，可能会对其各种性状及生理代谢特性和路径等产生影响，从而进一步影响植物与有害生物之间的相互关系(汤德良等,1996; 王朝生等,1987; 王琛柱等,1993)。因此，在进行新型转基因棉花生态环境安全评价的同时，棉花生理代谢方面的改变也成为其安全性评价研究的重要内容。

本文以新型转Cry1Ac+Cry2Ab棉花为实验材料，以转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花为对照，系统研究棉花叶片干物质积累、产量性状、生化物质含量、酶活性等的差异及其对棉田节肢动物个体数量和物种数的影响，为新型转双价抗虫基因棉花环境安全评价提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花(639020)，由中国农业科学院棉花研究所生物技术研究室提供；转Cry1Ac基因棉花(中棉所41)和非转基因棉花(中棉所49)，均由中国农业科学院棉花研究所遗传育种研究室提供。

1.2 实验方法

实验在中国农业科学院棉花研究所实验农场进行，棉花播种时间为2015年4月30日。转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花、转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花各种3个小区，小区面积150 m2，小区间随机排列。棉花生长过程中不喷施化学农药，田间其他管理措施按常规方法操作。

1.2.1 棉花叶片干物质积累及单株铃数 (1)棉花叶片干物质积累：分别在棉花生长的蕾期(6月20日)、花期(7月20日)和花铃期(8月20日)采集棉花顶部第1片完全展开叶，每个小区随机采集5片叶，称其鲜重，然后将叶片置于108 ℃杀青0.5 h，再置于80 ℃烘12 h后，称叶片干重，计算叶片干鲜比。

(2)单株铃数调查：于9月中旬调查棉花单株大铃(直径≥2 cm)数和小铃(直径<2 cm)数，每个小区随机选取3个点，每点顺行连续调查10株棉花。

1.2.2 生化物质含量测定 (1)粗酶液的提取。参照Grace & Logan (1996)的方法，稍做修改。称取样品0.3000 g，液氮研磨后，加入3 mL提取缓冲液[0.1 mol·L-1K2HPO4-KH2PO4(pH=7.6)、1 mol·L-1EDTA、0.3% Triton X-100、2% PVP]及少许石英砂于冰浴中研磨匀浆，18000g、4 ℃离心15 min，取上清液并分装保存于-80 ℃超低温冰箱，用于可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性的测定。

(2)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性测定。采用氮蓝四唑(p-Nitro-Blue tetrazolium chloride，NBT)比色法(李合生,2000)，稍做修改。3 mL反应体系：1.8 mL 50 mmol·L-1KH2PO4-K2HPO4(pH=7.6)缓冲液，0.3 mL 130 mmol·L-1甲硫氨酸(Met)，0.3 mL 750 μmol·L-1NBT，0.3 mL 100 μmol·L-1EDTA，0.3 mL 20 μmol·L-1核黄素。对照管加入0.005 mL 50 mmol·L-1KH2PO4-K2HPO4(pH=7.6)缓冲液，样品管加入0.005 mL酶液。对照管取2支，其中一支置于暗处，其余的试管置于4000 lx光下照射20 min，反应结束后，以不照光的对照管为空白，分别测定其他各管在560 nm下的吸光度。以抑制NBT光还原的50%为一个酶活力单位。

(3)过氧化氢酶(catalase,CAT)活性测定。参照Knörzeretal.(1996)的方法。利用H2O2(ε=39.4 mmol·L-1·cm-1)在240 nm的下降速率来测定CAT的活性。1 mL反应体系：10 mmol·L-1KH2PO4-K2HPO4(pH=7.6)缓冲液，10 mmol·L-1H2O2，10 μL酶液。利用酶液启动反应，每隔10 s记录一次，测定1 min内240 nm下吸光度的下降值。

(4)过氧化物酶(peroxidase,POD)活性测定。参照Maehly & Chance (1954)的方法。愈创木酚在POD的催化下氧化成茶褐色产物，此产物在470 nm处有最大光吸收(ε=26.6 mmol·L-1·cm-1)，利用络合物在470 nm的增加速率来测定POD的活性。1 mL反应体系：50 mmol·L-1KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 7.6)，0.1 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1愈创木酚，5 mmol·L-1H2O2，5 μL酶液。用酶液启动反应，每隔10 s记录一次，测定1 min内470 nm下吸光度的增加速率。

(5)抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性测定。参照Nakano & Asada (1981)的方法。利用ASA(ε=2.8 mmol·L-1·cm-1)在290 nm的下降速率来测定APX的活性。1 mL反应体系：50 mmol·L-1KH2PO4-K2HPO4(pH=7.0)缓冲液，0.1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1ASA，2.5 mmol·L-1H2O2，10 μL酶液。利用酶液启动反应，每隔10 s记录一次，测定0.5 min内290 nm下吸光度的下降值。

(6)谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)活性测定。参照Sunetal.(2009)的方法。GR催化GSSG与NADPH反应生成GSH与NADP+，NADPH在334 nm处有最大光吸收(ε=6.2 mmol·L-1·cm-1)，利用NADPH在334 nm的下降速率来测定GR的活性。1 mL反应体系：50 mmol·L-1KH2PO4-K2HPO4缓冲液(2 mmol·L-1EDTA，pH=7.8)，2.5 mmol·L-1GSSG，0.2 mmol·L-1NADPH，20 μL酶液。用NADPH启动反应，每隔10 s记录一次，测定2 min内334 nm下吸光度的减小速率。

(7)可溶性蛋白含量测定。利用考马斯亮蓝G-250染色法进行测定。20 μL酶液+980 μL水中加入3 mL考马斯亮蓝G-250染色液，振荡混匀，室温放置5 min后读取595 nm处的吸光度。利用牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)制作标准曲线。

(8)脯氨酸含量测定。参照李合生(2000)的方法。称取样品0.3000 g，加入3% 磺基水杨酸3 mL研磨成匀浆，转移至试管中，沸水浴10 min，冷却后转移至10 mL离心管中，3000 r·min-1离心10 min。取上清液2 mL，置于10 mL带塞试管中，加入1 mL冰乙酸和1 mL酸性茚三酮，沸水浴30 min，冷却后，加入2 mL甲苯，摇匀振荡30 s，静置片刻，取上层红色甲苯液相于比色杯中，在520 nm处测定吸光度。利用脯氨酸制作标准曲线。

(9)可溶性糖含量测定。参照李合生(2000)的方法。称取样品 0.1000 g，加入3 mL蒸馏水，转移至试管中，沸水浴30 min(2次)。冷却后，12000g离心5 min。取上清液100 μL，置于10 mL试管中，依次加入0.4 mL蒸馏水、3 mL 0.2%蒽酮—浓硫酸，充分振荡，沸水浴1 min，冷却至室温后，在630 nm处测定吸光度。利用蔗糖制作标准曲线。

(10)总氨基酸含量测定。参照李合生(2000)的方法。称取样品0.3000 g，在液氮中研磨成粉末，加入3 mL 10%乙酸，超声提取30 min(中间摇匀2次)，12000g离心5 min。取植物样品上清液100 μL+400 μL无氨蒸馏水，依次加入750 μL水合茚三酮、250 μL 0.1%抗坏血酸，置于沸水浴中加热15 min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，利用60%乙醇定容到8 mL，在570 nm处测定吸光度。利用亮氨酸制作标准曲线。

(11)棉酚含量测定。棉酚的提取和测定均参照国家标准法(国家标准化管理委员会,1991)。

(12)单宁含量测定。参照Howelletal.(1976)的方法。取棉苗组织约0.5 g，加95%乙醇匀浆，4000g离心10 min，将残渣用丙酮洗涤3次，离心后的沉淀物风干。准确称取0.0100 g风干沉淀物，加12 mL正丁醇∶HCl液(V∶V=95∶5)，混匀后90 ℃水浴1 h，4000g离心5 min，测上清液的D550 nm。以D550 nm·g-1·mL-1表示单宁含量。

1.2.3 昆虫结构调查 采用对角线5点取样方法(中华人民共和国农业部,2007)，从5月上旬至9月中旬，每5 d调查一次3种棉田，每点调查10株棉花，详细记录取样范围内地面和植株上昆虫的种类和数量，以及所有直接观察到的节肢动物的名称、发育阶段和数量。

1.3 数据统计方法

利用Excel软件对数据进行基本处理和筛选，并分析研究区调查结果；运用SPSS 17.0软件对所有数据进行统计分析；采用单因素t检验方差分析和Duncan′s差异显著性分析，检验不同棉田棉花生化物质含量和昆虫结构等的差异。

2 结果与分析

2.1 叶片干物质积累及单株铃数

棉花生长的蕾期、花期和花铃期，转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花、转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比呈先升高后降低的趋势，均在花期呈现最大值；3种类型棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比无显著差异(表1)。

单株大铃数表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花>转Cry1Ac基因棉花>非转基因棉花，小铃数表现为转Cry1Ac基因棉花

2.2 叶片酶活性和主要生化物质含量变化

2.2.1 酶活性 3种棉花叶片中SOD和POD活性在蕾期和花期没有显著差异，但在花铃期明显升高；CAT、APX和GR活性在3个生长阶段没有显著变化。3种棉花叶片中SOD、CAT、POD(6月份除外)、APX和GR活性均无显著差异(表2)。这表明外源基因的导入，未引起棉花叶片中主要酶活性变化。

2.2.2 营养物质含量 棉花生长的蕾期、花期和花铃期，3种棉花叶片中蛋白质、氨态氮含量没有明显变化，但脯氨酸和可溶性糖含量均表现为蕾期较低，花期升高，花铃期又下降的趋势；3种棉花叶片的蛋白质、氨态氮、脯氨酸(8月份除外)和可溶性糖含量均无显著差异(表3)。这表明外源基因导入后，棉花叶片中昆虫的营养物质含量未发生显著的变化。

2.2.3 次生代谢物质含量 3种棉花叶片中的棉酚含量在3个生长时期无显著变化，而单宁含量呈逐渐升高的趋势；3种棉花叶片中棉酚和单宁含量均无显著差异(表4)。这表明外源基因导入未引起棉花次生代谢物质的显著变化。

2.3 棉田昆虫个体总数与物种数

整个棉花生长发育时期，3种棉田中昆虫群落和害虫亚群落的昆虫个体总数均表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉田<转Cry1Ac基因棉田<非转基因棉田，且与非转基因棉田相比，转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉田昆虫群落和害虫亚群落的昆虫个体总数分别减少41.85%和33.02%，转Cry1Ac基因棉田昆虫群落和害虫亚群落的昆虫个体总数分别减少42.95%和34.19%，差异均达显著水平；天敌亚群落的昆虫个体总数无显著变化。3种棉田昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落的昆虫物种数均未发生显著变化(表5)。这表明转基因抗虫棉对棉田靶标害虫具有较强的抗性作用，天敌亚群落昆虫无显著变化。

表4 不同时期3种棉花叶片的次生代谢物质含量Table 4 The contents of main secondary metabolite of three kinds of cotton leaves in different stages

数据为平均值±SD。

Values are means±SD.

表5 不同时期3种棉田昆虫个体总数与物种数Table 5 The total number of individuals and species number of insects in 3 cotton fields

数据为平均值±SD。*代表不同品种间差异显著(P<0.05)。

Values are means±SD.*indicate significant differences among different varieties (P<0.05)．

3 讨论

棉花生长发育期干物质生产是连续不间断的过程,每个时期的累积量和特性不同(代英男等,2015)。棉花干物质与产量主要取决于品种的遗传特性，不同栽培措施和环境生态条件也会对其干物质产生重要的影响(雒珺瑜等,2015； 左娇,2013; 张兴华等,2012)。本研究结果表明，转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花、转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比在棉花不同生长时期均不同，但这些指标在3种棉花间无显著差异，表明外源双价基因的导入，对其干物质积累没有显著影响。此外，单株大铃数表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花>转Cry1Ac基因棉花>非转基因棉花，小铃数则表现为转Cry1Ac基因棉花

外源基因的导入，可能会对棉花植株内的生化物质及相关酶类产生影响(钦俊德,1987)，从而影响昆虫的取食行为(周明牂,1992)。本研究发现，SOD、POD、CAT、APX和GR等活性，以及蛋白质、脯氨酸、可溶性糖及氨态氮等含量在棉花不同生长时期表现不同，但3种棉花之间未见显著差异(除个别时期外)。而白素芬等(2001)对萌发棉花种子的酯酶同工酶酶谱的分析发现，转基因抗虫棉后代的酶带与亲本的酶带存在较大差异，说明外源基因的导入对棉花酯酶同工酶有影响；丁志勇等(2001)也发现，转Bt基因棉的可溶性过氧化物酶的活性显著高于常规棉，且转Bt基因棉中酯酶的酶谱和活性与常规棉明显不同。主要原因可能是所用的实验材料不同，且不同环境、不同时期植株体内生理代谢和所产生的生化物质含量不同(田晓莉等,2000)。

植物与昆虫在长期的进化过程中形成了相互适应和协同进化机制，害虫对寄主植物进行选择适应，而植物为抵抗害虫的侵害也发展了一套抗虫防御体系。转基因抗虫棉对棉田靶标类害虫具有较强的控制作用(路献勇等,2013，2014)，从而使转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉田和转Cry1Ac基因棉田昆虫群落和害虫亚群落的昆虫个体总数减少，但未引起物种数的变化(雒珺瑜等,2014)。

在进行生态风险评价时，除了关注转基因植物的外源基因及产物外，基因改造工程可能引起的其他生理改变也是一个重要方面。基因改造和组培过程可能在一定程度上影响原有基因的表达,改变转基因植物的生理特性,尤其是次生物质的代谢，进而影响转基因植物抗病、抗旱等性状，也可能会影响该转基因植物与其他动植物或微生物的关系，进而影响原有生态环境的生态系统结构。因此，该方面的研究尚需进一步系统的跟踪监测。

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(责任编辑:杨郁霞)

Effects of transgenicCry1Ac+Cry2Abcotton on biochemical substances and insects

LUO Junyu, ZHANG Shuai, ZHU Xiangzhen, LÜ Limin, WANG Chunyi, CUI Jinjie*
StateKeyLaboratoryofCottonBiology/InstituteofCottonResearch,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Anyang,Henan455000,China

【Aim】 A very important ecological task before introducing a new type of genetically modified cotton for large-scale commercial applications is to evaluate its biosafety. The secondary metabolism of cotton may be affected by the new gene introduced and even lead to a series of ecological effects. The physiological changes in the cotton cultivar are also an important part of safety evaluation of transgenic plants. 【Method】 This paper compares the transgenicCry1Ac+Cry2Abcotton andCry1Accotton with non-transgenic cotton in selected parameters during different critical developmental (seedling, budding and flowering and boll forming stages) periods. These parameters include the fresh and dry mass and ratio of dry mass to fresh mass of cotton leaf. Activities of important enzymes like SOD (super oxide dismutase), CAT (catalase), POD (peroxidase), APX (ascorbate peroxidase) and GR (glutathione reductase) were measured. We also measured the amounts of protein, ammonia nitrogen, soluble sugars, and secondary metabolites like gossypol and tannins. The number of individuals and species in different layers were investigated. 【Result】 During the budding, flowering and boll forming, the cotton leaf fresh mass, dry mass, their ratio, protein content and soluble sugars all showed first an increasing, then a decreasing trend. Activities of SOD and POD enzyme significantly increased in the boll forming stage, however, the other enzymes, CAT, APX and GR did not change significantly during the three periods. Ammonia nitrogen had no obvious change. Tannin contents gradually increased, while the gossypol content did not change significantly. Accumulation of dry matter, enzyme activities, nutrient content, and the amounts of secondary metabolites had no significant difference between the three kinds of cotton leaves. The number of big bolls was highest inCry1Ac+Cry2Abcotton, followed byCry1Accotton and non-transgenic cotton； the number of small bolls was lowest inCry1Accotton, followed byCry1Ac+Cry2Ab, then non-transgenic cotton. The total number of insect individuals in the insect community and pest sub-community showed thatCry1Ac+Cry2Abcotton

transgenicCry1Ac+Cry2Abcotton; biochemical substance content; total number of insect individuals; species number

10. 3969/j.issn.2095-1787.2017.02.007

2016-03-15 接受日期(Accepted)： 2016-05-02

转基因生物新品种培育重大专项(2016ZX08011-002)

雒珺瑜， 女， 副研究员。 研究方向: 棉田害虫综合防治与转基因生物安全

*通讯作者(Author for correspondence), E-mail: cuijinjie@126.com