液相色谱-串联质谱法应用于动物源性食品中多族药物筛查确证的研究进展

尹志强,宋月,柴婷婷,王昕璐,贾琪,杨曙明,邱静

(中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量与安全重点实验室，北京，100081)

液相色谱-串联质谱法应用于动物源性食品中多族药物筛查确证的研究进展

尹志强,宋月,柴婷婷,王昕璐,贾琪,杨曙明,邱静*

(中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量与安全重点实验室，北京，100081)

为了筛查和监测动物源性食品中因不当或非法使用兽药以及一些人用药物而导致的药物残留，液相色谱-质谱联用技术成为该领域中应用最为广泛的痕量检测技术。该文从样品前处理净化方法、最新研究思路、基质效应评价、质谱检测器选取等方面对液相色谱-串联质谱法在动物源性食品中多族药物筛查确证应用的研究进展进行了综述，并对这一应用的发展前景进行了展望，希望能为相关研究的开展提供参考和启发。

液相色谱-串联质谱法；动物源性食品；兽药；残留；筛查；综述

畜牧生产过程中，兽药的广泛使用在防治畜禽动物疾病、降低牲畜发病率和死亡率、促进生长、改善产品品质等方面起到了积极的作用。然而由于存在各类兽药以及人用药等药物的滥用、误用及不遵守休药期等现象[1]，动物源性食品中可能存在大量的药物残留，从而对消费者的身体健康造成巨大的潜在危害，如“三致”作用、激素样作用、耐药性产生以及引发过敏反应等[2-3]。

我国目前针对动物源性食品中药物残留检测方法主要还是以药物分类检测为主，对于非检测项目药物残留筛查能力不足，多个指标分项检测，耗时费力，难以体现产品整体特征[4]，无法满足大批量样品高效快速测定的目的，并且无法对外源物质尤其是未知有害药物进行检验。而如今，兽药的使用更趋向于多成分低含量添加代替之前的单一组分高浓度添加，使得动物产品的安全监控面临技术支撑极为不足的问题。因此建立快速、有效、覆盖面广的动物源性食品中药物残留的筛查方法对保障动物源性食品质量安全、保护消费者健康具有非常重要的意义。

动物源性食品中药物残留的常用检测方法主要包括酶联免疫法[5]，分子印迹法[6]，微生物生化法[7]等，但这些方法都或多或少存在一些弊端，比如药物交叉反应、识别位点易于破坏、灵敏度低等问题，使得这些技术只能进行半定量检测，而且无法满足高通量快速筛查的目的。随着质谱技术的发展，液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)得到了广泛的应用，它是集色谱高效快速的分离效果和质谱准确灵敏的定性定量分析能力于一身的分析方法，作为复杂样品基质中未知物筛查检测的重要工具开辟了痕量药物残留检测的新时代[8-9]。

1 样品前处理净化技术

决定一个筛查方法与众不同的地方便是样品前处理方式的巧妙性，而对样品前处理效果影响最大的又是其中的净化手段。动物源性食品基质复杂，大量的磷脂、蛋白质等杂质会对检测结果产生巨大影响，因此在有机溶剂提取之后的净化步骤是决定一个前处理方法是否优异的最重要环节，同时也是评价所建立方法是否优异最重要的因素。固相萃取技术是净化阶段中最常用的手段，一般包括以下几种：反向非极性萃取、正向极性萃取、离子交换萃取、共价萃取、高级聚合物萃取以及专用固定相等。在动物源性食品的多族药物筛查前处理中，固相萃取大多应用在3个方面，分别是固相萃取(SPE)柱，分散固相萃取(d-SPE)以及快速涡流在线样品制备和净化技术。其中，SPE固相萃取柱净化效果最好，d-SPE应用广泛操作简便，快速涡流在线样品制备和净化技术的效果介于二者之间。除此之外还有SPE与分子印迹进行结合[10]等，但是由于选择性过高在大范围筛查应用中显得更力不从心。

1.1 SPE固相萃取技术

SPE固相萃取小柱在萃取过程中的高选择性使其很难成为多族药物检测的一个通用方法，因此仅局限于少数几类性质相似药物同时检测的应用，其中，Oasis HLB、Oasis MCX、SCX柱使用得较为广泛[11]。我国国标SN/T 2624—2010[12]中对76种碱性药物检测的前处理方法为使用乙腈、异丙醇和柠檬酸缓冲液进行2次提取，提取液加异丙醇旋蒸浓缩，柠檬酸缓冲液润洗梨形瓶，合并的洗液使用MEP柱和MCX柱串接净化后氮吹浓缩上机检测。虽然数据采集仅需要23 min，但是该方法的前处理操作相当繁琐，耗时长，难以满足高通量筛查的目的。HOU[13]等人在检测牛奶中的46 种兽药包括磺胺类、喹诺酮类和苯并咪唑类药物及其代谢物时，将提取液经过Oasis MCX固相萃取小柱净化浓缩，对于有最大残留限量(MRL)的分析物，方法的确定限(CCα)为11～115 μg/kg，对于没有MRL的分析物，方法的CCα低至0.01～0.08 μg/kg。YU等人[14]将Oasis HLB柱作为SPE净化步骤应用在鸡肉、猪肉和鱼肉中18 种抗生素残留检测前处理中，其中包括大环内酯类、内酰胺类和喹诺酮类抗生素等。方法数据采集耗时20 min，所有药物的定量限(LOQs)均能低于10 ng/kg，利用此方法可在1天之内分析处理30个未知样品。同时，多壁碳纳米管(MWCNTs)是作为一种具有高稳定性和较强吸附性能的新型纳米材料,已被广泛用于农药残留和兽药残留的检测。如，曹慧[15]采用多壁碳纳米管固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱技术同时测定蜂蜜中的磺胺类、喹诺酮类、硝基咪唑类和四环素类等52种兽药残留，该方法将氧化处理后的多壁碳纳米管自制成萃取小柱使用，数据采集时间20 min，方法定量限为1.5～7.5 μg/kg，经过评价发现方法自制的新材料SPE小柱与商品化HLB小柱相当，尽管重现性稍差，但是由于MWCNTs 材料的廉价性让具有一定的应用前景。虽然类似的关于固相萃取小柱应用的研究有很多，但是由于SPE的选择性导致方法可同时检测的药物种类和数目都太少，并且由于SPE繁琐的操作步骤使得方法前处理耗时较长，因此很难成为一个通用的高通量多残留筛查检测的样品前处理方法。

1.2 分散固相萃取

分散固相萃取(d-SPE)是作为最简单便捷的分散固相萃取广泛应用于QuEchERS方法中。传统的d-SPE能有效去除各种基质中的有机酸、糖类、脂类、固醇以及色素，如N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳和C18等。

1.2.1 QuEchERS技术

传统分散固相萃取材料应用最广泛的便是在2003年在美国诞生的的革新技术QuEchERS (Quick， Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe)，这是一种快速、简便、 价格低廉的分析方法实现高质量的农兽药多残留分析[16]。该方法可以去除有机酸、色素和其他潜在的污染物等，并且具有高样品通量，低的无氯溶剂使用率以及宽的应用范围等优点。

最原始建立方法主要应用在农药残留检测中，在此基础上，通过缓冲液和C18的引入，后续又建立了2个改良的QuEchERS方法，LEHOTAY 等人在原方法中引入醋酸缓冲体系，该方法目前已成为AOAC官方方法2007.01，ANASTASSIADES 等人在原方法中引入相对缓冲能力较弱的柠檬酸缓冲体系，该方法目前被欧盟采用列为标准方法EN 15662。3个方法指南具体操作如图1所示，但至今仍没有统一，但都是经过验证并可以满足常见农药残留检测的要求。QuEchERS方法最大的优势是灵活性强，但同时这也成为建立该方法的最大的困难。尽管最初的QuEchERS方法应用在农药残留检测中，但是如今在兽药的残留检测中也发挥着至关重要的作用。将QuEchERS官方方法作为模板，根据自身检测目标物性质、基质组成、实验条件等因素，通过调节萃取剂、pH条件、加盐、改变体积比、加水、改变吸附剂等条件的变化，建立更加量身定制的QuEchERS方法。

图1 QuEchERS官方标准方法Fig.1 Official standard methods ofQuEchERS

GEORGE STUBBINGS[17]利用 QuEchERS 方法建立了鸡肉组织中100种常见抗生素类兽药筛查的 LC-MS/MS方法，该研究评价了6种提取方法，2种净化方法，最终确定的前处理方法为使用含有15 mL 1 %乙酸的乙腈进行提取，加入5 g无水硫酸钠和500 mg的Bondesil NH2 吸附剂进行净化，提取液浓缩复溶后上机检测28 min。该方法简便快速， ABDALLAH[18]也同样使用优化的 QuEchERS 方法建立了动物组织中22种磺胺类药物及其代谢物筛查的混合线性离子阱-串联轨道阱质谱(HPLC-HRMS)方法，样品前处理使用水和含1%乙酸的乙腈溶剂进行提取，加入无水硫酸镁、氯化钠盐析，取上清液加入丙基乙二胺(PSA)和无水MgSO4净化，最后经氮气吹干复溶后上机检测，经英国FAPAS分析实验室能力验证表明该方法准确灵敏实用。类似的研究报道很多，因此，在动物源性食品中多族药物残留筛查确证的前处理方法中，QuEchERS 这一简便快速的通用样品制备与净化技术作为已经成为一个至关重要的样品前处理方法，尽管一般SPE小柱的确会比分散基质萃取更能有效去除杂质，但会降低某些极性药物的回收，同时也存在无水MgSO4可能会堵塞筛板的可能，所以QuEchERS作为一种至关重要的方法被用在越来越多领域检测各种不同类型基质的样品。

1.2.2 新型分散固相萃取材料的应用

如今，一些新型吸附剂如纳米材料或者实验室新合成的吸附材料也取得了广泛的应用。如，应永飞[19]曾采用MWCNTs 为吸附剂的d-SPE净化、LC-MS测定饲料中11种β-受体激动剂。与上述曹慧所建立方法不同的是，应永飞将MWCNTs作为类似PSA那样的分散固相萃取材料应用，尽管依旧采取类似洗脱的程序，但是与目前常用的阳离子交换固相萃取柱方法比较，大大缩短了检测前处理时间,降低了检测成本，但是由于MWCNTs吸附性较强，只适合很少一部分药物的前处理应用。 CASTILLO-GARCA[20]合成了新纳米复合材料应用于检测肉组织中3种四环素类和3种酸性喹诺酮类药物。该纳米复合材料利用表面包被铽、铕离子的磁性纳米颗粒通过共沉淀法合成。该方法的原理是在与分析物吸附作用的基础上，形成相应的螯合物，之后通过合适pH的有机溶剂进行洗脱，可以应用在大多数能够螯合铽、铕离子的有机化合物提取中，但是合成部分太过繁琐，方法实用性并不高。由此可见，尽管一些新型吸附材料操作较复杂，但是相比其他净化方法而言，d-SPE简便快速，节省人力物力，可实现性最高，在多族药物的筛查前处理应用最广泛，当下的趋势是寻找更加效率高适用范围广的新型d-SPE材料。

1.3 快速涡流在线样品制备和净化技术

快速涡流在线样品制备和净化技术，也称为快速涡流液相色谱(High turbulence liquid chromatography，TurboFlow技术)，是基于色谱原理结合扩散、化学和体积排除原理的在线样品制备和净化技术。此技术中的净化柱以多孔大粒径填料为吸附剂，不同类型的吸附剂表面用不同化学基团修饰使其具有特殊的吸附性。ZHU等人[21]利用TurboFlow结合LC-MS/MS测定牛奶中8类共88种兽药残留。样品提取液上样于已经被水活化和流动相平衡的Turboflow Cyclone TM柱中，使用V(乙腈)∶V(异丙醇)∶V(丙醇)=4∶4∶2淋洗，最后通过容积环中的200 μL充满乙腈和水体积比为6∶4进行洗脱进入液相色谱分析柱，整个分析过程为39 min，方法的LOQ为0.5～10 μg/kg。KATERINA等[22]也同样使用类似的Turboflow Transcend TM TLX-1系统结合TSQ Quantum Access MAXLC-MS/MS检测牛奶中36种7大类不同的抗生素。因此，相比传统的净化技术，快速涡流在线样品制备和净化技术结合液相质谱检测凭借其高效率方便快捷的优势已经得到非常广泛的应用。

2 当下研究的新思路

由于本研究对同时检测的多族药物的种类和数量有较高的要求，将彼此之间化学性质相差较大的不同目标物一视同仁的做法显然是无法满足要求的，因此，对计划的目标物以及应用要求进行合理分类才是解决此问题的思路。

MAKI KANDA[23]等人的研究将所选目标分析物分为强极性化合物和中等极性化合物，首先强极性化合物使用Na2EDTA-Mcllvain缓冲液进行提取，然后中等极性化合物使用含0.1 %甲酸的乙腈提取，接下来将第1次提取液使用固相萃取柱净化，将第2次提取液作为洗脱液添加到同一固相萃取柱上，从而可以将强极性化合物和中等极性化合物同时洗脱下来上机检测。STEPHEN W C CHUNG和CHI-HO LAM[24]同样将所选的15类78种化合物按照不同极性分类，样品使用乙腈和水混合提取液提取及低温冷冻分层，之后分别将含有亲脂性化合物的乙腈和含有亲水性化合物的水分别通过反相液相色谱(RPLC)和亲水作用色谱(HILIC)进行分离检测。前者的前处理需要大量时间，数据时间为25 min，后者的虽然前处理相比前者而言操作更节省一些步骤和时间，但是由于需要采用不同的色谱柱和不同的采集模式，数据采集时间各为20 min，完成1个样品的检测需要耗时80 min。因此，无论是前处理对目标物进行分类处理还是在质谱阶段对目标物分类检测都需要额外大量的时间，无疑降低了实验效率，但是为了达到满意的覆盖度这又是一个迫不得已的选择，在此启示的基础上，建立更简便快速的方法成为下一个研究目标。

实际应用中，不仅可以根据目标物进行分类，还可以根据检测的目标与应用的要求进行分别对待。WANG等[25]人建立了牛奶中11大类共105种兽药残留的超高效液相色谱串联轨道阱质谱(UHPLC-Q-Orbitrap)检测方法，其前处理方法为使用优化的盐析液相提取技术(salting-out supported liquid extraction, SOSLE)，主要步骤包括药物提取与蛋白沉淀、盐析分离、SPE净化以及浓缩等操作。其目标物列表分为三大类：A、化学性质稳定的89种药物；B、13种以青霉素和β-内酰胺类抗生素为主的化学性质不稳定的药物，回收率可能小于70%或者大于120%，但是依旧可以进行定量；C、包括3种药物，分别是氨比西林、头孢拉定和泰乐菌素B，他们三者可以满足筛查的要求但是无法准确定量。因此，在动物源性多族药物的残留检测中，如果不能保证所有的药物满足需要，可以根据不同的要求对他们分别对待，如将一些禁止使用的药物作为重点考虑对象，尽可能提高其检测灵敏度，而一些不常用的药物可以放宽其要求标准，能够满足筛查的需求即可。

3 基质效应的评价

液质联用技术是基于物质的质荷比进行定性和定量，因此，任何能够干扰待测物离子化的物质都可能影响结果的灵敏度，这些基质成分一般为提取或分离过程中产生的共提物和共流出等杂质，这些物质改变了离子源对目标物离子化的效率，导致离子抑制或增强的产生，即引入了基质效应的概念[26]。尽管药物自身的化学性质对基质效应的影响相比前处理方法而言更重要，但是通过对基质效应的考察能够指导前处理方法的建立，并且是评价所建立方法灵敏度和选择性的重要指标。目前最直观评价基质效应的方法主要有2种：(1)柱后灌注法(post-column infusion method)(如图2所示)，(2)提取后加入法(post-extraction spiking method)[27-28]。

图2 柱后灌注法示意图Fig.2 The basic flowsheet of post-column infusion method

RYAN BONFIGLIO[29]设计了4部分实验采用SRM扫描模式评估3种药物受到的基质效应影响，首先是利用流动注入模式(FIA)比较溶剂标样和不同前处理方式基质空白提取液稀释标样的响应强度差别，以此来衡量基质干扰物是否对标准品的响应有影响。之后采用柱后进样方式评价在2.5 min内不同前处理基质空白内源性干扰的影响情况。第3部分与第2部分除采用混合标样和信号采集时间为20 min外操作完全一致，以此评价在整个分析过程中干扰的基质内源性物质是否被洗脱下来。最后一部分依旧用柱后灌注的方式模拟实际进样过程，将混合标样以每两 min的时间间隔注入系统，观察在基质效应影响条件下信号恢复到初始进样强度的快慢。通过这4部分实验，可以直观地评价不同前处理，不同极性药物在最开始进样阶段以及整个分析过程之后的基质效应，作为选择最适前处理方法的重要影响因素。对于多族药物的筛查研究而言，这种方式可用来分析少数几种基质效应较明显的强极性物质，能够对他们在整个分析环节受到的基质效应进行完整的考量。

YE[30]认为磷脂类物质是造成生物样品基质效应的主要因素，他除了同样利用柱后灌注的方式进行评价以外，也将一些典型磷脂类物质如甘油磷酸胆碱与目标药物同时在MRM模式下检测，观察二者提取流色图的重叠部分，从而通过选择不同的色谱柱、流动相以及洗针液使他们各自的提取色谱图能够很好的分开，从而减轻对易受影响目标物的基质效应。因此，在多族药物的筛查研究中，可选取自认为可疑的能够找到MRM离子对的干扰物，利用这种方式分析其是否会对一些敏感目标物产生干扰。

LIU[31]通过观察空白基质在MRM检测模式下是否有信号响应推测对目标物的影响。与YE不同的是，LIU并没有将可能干扰物的MRM离子对列入检测列表，而是直接观察空白提取液是否能产生与目标分析物相近质荷比的物质从而可能造成基质干扰。在多族药物的筛查检测中，由于同时检测的目标物很多，并且对基质效应的关注更多的是干扰物对绝大多数目标物的影响，而不是探究干扰物具体是什么或者干扰物对某几个典型目标物的影响，因此这种研究方式是最简便实用且直观的。

另外还可以通过重量分析法[32]称量前处理净化前后提取液的基质的质量来预测基质效应的影响，重量差越大的前处理方法可能造成的基质干扰越小，但是由于具体实验过程中水分的控制耗时较长，而且结果可能受环境以及其他多种条件影响，所以重量分析法使用较少。

在建立多族药物筛查方法时采用更多的是提取后加入法，即通过比较溶剂标样和基质标样的拟合曲线的差别来计算该目标物的信号比，从而将基质效应进行量化比较。例如，大多数的喹诺酮类药物(诺氟沙星、奥比沙星、奥索利酸等产生基质抑制现象)和磺胺类药物(磺胺多辛产生基质抑制，磺胺嘧啶产生基质增强等)的基质效应较小；四环素类、氨基糖苷类、林可酰胺类抗生素、类固醇类等易造成基质抑制现象；大多数大环内酯类抗生素会产生基质增强现象，少数如螺旋霉素，替米考星、泰乐菌素等会产生基质效应[23,33]。不同的前处理方式，不同的基质，不同的药物其基质效应都会有差别，需要具体情况实际考量，在此就不一一赘述。

以上这些方式，无论是可视化的基质效应的观察，还是具体基质效应值的计算，最根本的目的是通过选择不同的色谱柱、流动相、洗针液等得到最优的前处理方法以及干扰最小的色谱图。除此之外，降低基质效应还可以采取优化前处理条件、优化色谱分离以及质谱检测条件，以及使用基质标建立定量拟合曲线、浓缩后更换溶剂复溶、使用内标定量等方法。

4 质谱检测技术

LC-MS-MS中的质谱检测器通常分为低分辨质谱和高分辨质谱两大类，一般低分辨质谱中最常用的便是三重四极杆质谱(QqQ)和三重四极杆-离子阱串联质谱(Q-Trap MS)，高分辨质谱中常用的是飞行时间质谱(Tof MS 、 Q-Tof MS)和轨道阱质谱(Orbitrap Ms)。

QqQ以及Q-Trap MS凭借其高灵敏度和高选择性成为质谱定量方面目前灵敏度最高，选择性最好，扫描最快的技术。先进的MRM采集方式如Scheduled MRM TM采集方式(AB SCIEX公司)、DMRM(Agilent公司)等能够智能地利用色谱峰的保留时间自动优化MRM的驻留时间，以达到最佳的定量结果[34]，这一点对于上百种的药物同时筛查检测具有重要意义[35]。Q-Trap独有的MRM3技术通过孙离子对的选择大大提高复杂基质中的检测选择性和灵敏度。同时，Q-Trap技术独特的MRM-IDA-EPI扫描方式可以同时获得MRM数据以及感兴趣的二级全扫描质谱图，通过自建谱库比对进行半未知或完全未知的筛查。周炜等人[36]利用此方式确定了某品牌部分兽药中非法添加了氯丙那林，但这种方式的缺点是无法获得高分辨质谱的精确质量数和高通量，并且目前只能依赖标准物质及谱库的建立，过程繁琐又需要长期积累与维护，但是为未知药物的筛查及定性确证提供了一个有效的思路与方法。

因此低分辨质谱在LC/MS检测中提供了一个通用的相当大数量兽药多残留检测的应用。DASENAKI MARILENA E[33]运用LC-ESI-MS/MS成功建立了在黄油、牛奶、鸡蛋、鱼肉中115种兽药残留筛查方法，使用EDTA 0.1%(w/v)-acetonitrile-methanol(1∶1∶1,体积比)对样品进行提取，经过正己烷除脂，冷冻除杂等净化步骤后上机检测，方法检出限0.008-3.15 μg/kg。ANDREIA FREITASI[37]利用UHPLC-MS/MS技术建立了肌肉组织中7类21种抗生素药物的同时检测确证方法，简单的前处理步骤使实验周期大大缩减，确定限(CCα)和检测容量(CCβ)分别确定为0.01-310 μg/kg、0.02-330 μg/kg。XIA[38]等也建立了高效液相色谱-三重四极杆串联质谱检测动物源性食品组织和肝肾基质中23种兽药的方法，样品经正负离子扫描快速转化方式进行数据采集，方法检出限3～100 μg/kg。这些报道不胜枚举，由此可见，LC-MS/MS技术在动物源性食品中多族兽药残留的筛查检测确证应用中凭借其超高的选择性和灵敏性发挥着至关重要的作用。

QqQ以及Q-Trap MS尽管具有多样性的功能和高超的定量分析能力，但它对非目标化合物的检测和未知物的定性分析则不能完全胜任，通过利用已知标品及其谱库的应用，只能将其定位成半未知化合物筛查。并且同时检测的化合物数量受到限制，一味的追求数量只会降低每种化合物检测的数据点数导致无法令人满意的峰形。高分辨质谱QTof以及Orbitrap等主要应用于全化合物的筛查检测和未知物定性分析，在食品安全分析领域有着非常重要的作用[39-40]。高分辨质谱可以通过全扫描的模式采集全部的不受数量限制的化合物信息，采集的分子质量数和同位素匹配更加精确，并且其数据回顾分析功能[41]以及在代谢组学中的独特使得高分辨质谱具有无法比拟的优势。

MARILENA E等人[42]利用UHPLC-QTOF MS建立了牛奶和鱼肉组织中143种药物残留同时筛查方法，尽管前处理过程由于震荡、冷冻、SPE固相小柱萃取以及浓缩等步骤的应用导致耗时长操作繁琐，但是数据采集时间仅需要17 min，结果表明在150 ng/mL(牛奶中)和200 μg/mL(鱼肉中)浓度下，2种基质中可成功准确检测出80 %的药物，当检测浓度都降低10倍之后，仍可以检测定量60%的药物。JIA[43]利用UHPLC-ESI Q-Orbitrap建立了同时检测婴儿食品中333种农药和兽药(其中兽药包括75种)的法，使用优化过的QuEChERS方法对样品进行前处理后上机检测15 min，方法的定量限为0.01～9.27 μg/kg。由此可见，利用高分辨质谱可以在短时间内高通量检测多族药物，并且在定性的准确度方面也较低分辨质谱更略胜一筹。另一方面对于兽药代谢产物等完全未知物研究的应用才真正发挥了高分辨质谱之所以能够与低分辨质谱最与众不同的优势。例如，ALEXANDRA JUNZA[44]利用LC-TOF和LC-LTQ-Orbitrap研究了不同热处理生奶中磺胺类药物的代谢物以及热不稳定转化物，共发现了4种喹诺酮药物的27种转化产物以及恩诺沙星的24种代谢产物。利用同样的方法，ALEXANDRA JUNZA还研究了热处理生奶中四种内酰胺类化合物以及8种第1次被发现的来自水解和脱羧反应的转化产物[26]。尽管动物源性食品中药物的相关代谢物研究仍十分复杂，但是，这样类似的研究为日后其他药物代谢物的研究产生了巨大的指导意义。从以上列举可以看出，液相色谱-高分辨串联质谱能进行高通量的目标物或非目标物筛查，能够实现可靠的确证和定量分析，其高稳定性和可操作性为前沿研究和常规检测提供了更加先进的分析手段。

单一仪器检测还不足以使检测结果完全确信，为了使检验结果更加真实可信，建立多套仪器检测方法联合运用，彼此互相补充确证，充分发挥利用各类分析仪器的优势，将定性和定量需求都能达到最优的结果，从而大大降低检测结果的假阳性率。GARCA-REYES[27]等人建立了LC-TOF-MS和LC-MS/MS结合筛查确证目标和非目标农药的方法。其方法基于3步，首先，利用LC-TOF-MS完成快速全面的自动化筛选。在实际样品分析之前，使用每种农药的单一标准溶液进行扫描，确定每种农药的保留时间、精确质量数以及同位素峰形等信息。然后将样品结合之前建立的各种信息进行初步鉴定。随后，将阳性样品通过LC-TOF-MS精确质量扫描，完成定性确认。最后，通过LC-MS/MS在MRM模式下完成定量。虽然此方法的目标物是针对农药，但是同样对兽药残留筛查检测方法的建立具有指导意义.

5 结论与展望

随着动物源性食品中多族药物残留高通量筛查确证技术研究的不断发展和更新，检测方法也不断向着快速、准确、高效的方向发展。简化复杂样品前处理步骤，建立通用性的不同基质检测方法，提高样品制备自动化程度，增加样品通量，提高检测灵敏度，普遍推广仪器，将是今后的重要发展方向。与此同时应该加大各种新兴技术的利用，不仅限于实验室科研，要发展成真正在实际工作中得以利用，使科研真正与实际需求相结合，将各种方法有效的在各部门得以最大程度利用，确保动物源食品安全添砖加瓦，为保护广大人民群众身体健康和生命安全贡献力量。

今后的研究策略：(1)将统计学以及模型建立的方法应用在前处理条件摸索中，如simplex-lattice mixture design[28]、Doehlert experimental design[45]等这些表面响应方法来优化前处理中类似体积、pH等影响因素，使最优结果更加形象突出并且具有说服力。(2)将目标物的范围不断扩大，同时不仅仅关注动物源性食品中兽药以及某些人用药和其他非法添加物的使用，将农药以及生物毒素等筛查检测也列入其中，更大范围的筛查动物源性食品中尽可能多的隐性农兽药残留以及化学危害物污染。(3)新材料，新技术，新仪器的应用。如新纳米材料EMR或者新填料SPE固相萃取小柱等的试用、高压液相提取(PLE)的试用、以及快速涡流在线样品制备和净化技术的广泛使用等。(4)多种仪器检测联合使用，互相确证，例如将低分辨质谱的定量优势与高分辨质谱的定性优势进行有机结合，将各自的检测结果互相对比确证，使检测结果更加真实可靠。(5)加大组学在常见兽药代谢物研究中的应用。

[1] MALIK A K, BLASCO C, PICO Y. Liquid chromatography-mass spectrometry in food safety[J]. J Chromatogr A, 2010, 1217(25): 4 018-4 040.

[2] KAUFMANN A, BUTCHER P, MADEN K, et al. Development of an improved high resolution mass spectrometry based multi-residue method for veterinary drugs in various food matrices[J]. Analytica Chimica Acta, 2011, 700(1-2): 86-94.

[3] GRANELLI K, BRANZELL C. Rapid multi-residue screening of antibiotics in muscle and kidney by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 586(1-2): 289-295.

[4] 曾庆方, 赵春杰, 王颜红, 等. HPLC-MS 指纹图谱用于牛奶中部分有害药物的筛查研究[J]. 中南药学, 2010, 8(6)412-416.

[5] 申惠敏, 杜娟, 贾秀珍. β-受体激动剂类残留检测方法[J]. 中国畜牧业, 2014(19):56-57.

[6] 王培龙. β-受体激动剂及其检测技术研究[J]. 农产品质量与安全, 2014(1):44-52.

[7] 李延华, 王伟军, 张兰威, 等. 微生物法检测牛乳中 β-内酰胺类抗生素残留的对比研究[J]. 中国抗生素杂志, 2009，34(1): 63-64.

[8] BOSCHER A, GUIGNARD C, PELLET T, et al. Development of a multi-class method for the quantification of veterinary drug residues in feedingstuffs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(41): 6 394-6 404.

[9] HO Y B, ZAKARIA M P, LATIF P A, et al. Simultaneous determination of veterinary antibiotics and hormone in broiler manure, soil and manure compost by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1262(21):160.

[11] WANG Y, LI X, ZHANG Z, et al. Simultaneous determination of nitroimidazoles, benzimidazoles, and chloramphenicol components in bovine milk by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2016, 192:280-287.

[12] 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准. SNT 2624—2010动物源性食品中多种碱性药物残留量的检测方法液相色谱-质谱质谱法(76种)[S].北京：中国标准出版社，2010.

[13] HOU X-L, CHEN G, ZHU L, et al. Development and validation of an ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for simultaneous determination of sulfonamides, quinolones and benzimidazoles in bovine milk[J]. Journal of Chromatography B, 2014, 962c(7):20-29.

[14] TANG Y Y, LU H F, LIN H Y, et al. Development of a Quantitative Multi-Class Method for 18 Antibiotics in Chicken, Pig, and Fish Muscle using UPLC-MS/MS[J]. Food Analytical Methods, 2012, 5(6): 1 459-1 468.

[15] 曹慧, 陈小珍, 朱岩, 等. 多壁碳纳米管固相萃取技术同时测定蜂蜜中多类兽药残留[J]. 高等学校化学学报, 2013, 34(12): 2 710-2 715.

[16] MARTINS M T, MELO J, BARRETO F, et al. A simple, fast and cheap non-SPE screening method for antibacterial residue analysis in milk and liver using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Talanta, 2014, 129：374-383.

[17] STUBBINGS G, BIGWOOD T. The development and validation of a multiclass liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) procedure for the determination of veterinary drug residues in animal tissue using a QuEChERS (QUick, Easy, CHeap, Effective, Rugged and Safe) approach[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 637(1-2): 68-78.

[18] ABDALLAH H, ARNAUDGUILHEM C, JABER F, et al. Multiresidue analysis of 22 sulfonamides and their metabolites in animal tissues using quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe extraction and high resolution mass spectrometry (hybrid linear ion trap-Orbitrap)[J]. Journal of Chromatography A, 2014, 1355(6)：61-72.

[19] 应永飞, 陈慧华, 朱聪英. 多壁碳纳米管分散固相萃取结合 LC-MS/MS测定饲料中 11 种 β2-兴奋剂[J]. 宁波农业科技, 2013(1):2-11.

[20] CASTILLO-GARCA M L, AGUILAR-CABALLOS M P, GMEZ-HENS A. A europium-and terbium-coated magnetic nanocomposite as sorbent in dispersive solid phase extraction coupled with ultra-high performance liquid chromatography for antibiotic determination in meat samples[J]. Journal of Chromatography A, 2015, 1425:73-80.

[21] ZHU W-X, YANG J-Z, WANG Z-X, et al. Rapid determination of 88 veterinary drug residues in milk using automated TurborFlow online clean-up mode coupled to liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Talanta, 2016, 148:401-411.

[22] BOUSOVA K, SENYUVA H, MITTENDORF K. Quantitative multi-residue method for determination antibiotics in chicken meat using turbulent flow chromatography coupled to liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2013, 1274(2):19-27.

[23] KANDA M, NAKAJIMA T, HAYASHI H, et al. Multi-residue Determination of Polar Veterinary Drugs in Livestock and Fishery Products by Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry[J]. Journal of AOAC International, 2015, 98(1):230-247.

[24] CHUNG S W C, LAM C-H. Development of a 15-class multiresidue method for analyzing 78 hydrophilic and hydrophobic veterinary drugs in milk, egg and meat by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Anal Methods, 2015, 7(16):6 764-6 776.

[25] WANG J, LEUNG D, CHOW W, et al. Development and validation of a multiclass method for analysis of veterinary drug residues in milk using ultrahigh performance liquid chromatography electrospray ionization quadrupole orbitrap mass spectrometry[J]. J Agric Food Chem, 2015, 63(41): 9 175-9 187.

[26] JUNZA A, MONTANÉ A, BARBOSA J, et al. High resolution mass spectrometry in the identification of transformation products and metabolites from β-lactam antibiotics in thermally treated milk[J]. Journal of Chromatography A, 2014, 1368(9):89-99.

[28] DORIVAL-GARCA N, JUNZA A, ZAFRA-GMEZ A, et al. Simultaneous determination of quinolone and β-lactam residues in raw cow milk samples using ultrasound-assisted extraction and dispersive-SPE prior to UHPLC-MS/MS analysis[J]. Food Control, 2016, 60(3)：382-393.

[29] BONFIGLIO R, KING R C, OLAH T V, et al. The effects of sample preparation methods on the variability of the electrospray ionization response for model drug compounds[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1999, 13(12): 1 175-1 185.

[30] YE J-H, PAO L-H. Using Visualized Matrix Effects to Develop and Improve LC-MS/MS Bioanalytical Methods, Taking TRAM-34 as an Example[J]. PLOS ONE, 2015, 10(4)：eD118818.

[31] LIU Y, HAN S, LU M, et al. Modified QuEChERS method combined with ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the simultaneous determination of 26 mycotoxins in sesame butter[J]. Journal of Chromatography B, 2014, 970:68-76.

[32] GEIS-ASTEGGIANTE L, LEHOTAY S J, LIGHTFIELD A R, et al. Ruggedness testing and validation of a practical analytical method for >100 veterinary drug residues in bovine muscle by ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr A, 2012, 1258:43-54.

[33] DASENAKI M E, THOMAIDIS N S. Multi-residue determination of 115 veterinary drugs and pharmaceutical residues in milk powder, butter, fish tissue and eggs using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Anal Chim Acta, 2015, 880(7):103-21.

[34] SCHREIBER A. AB SCIEX QTRAP 4500系统定量分析和定性确认食品中的多残留农药[J]. 2012年中国食品与农产品质量安全检测技术应用国际论坛, 2012:166-74.

[35] YIN Z, CHAI T, MU P, et al. Multi-residue determination of 210 drugs in pork by ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2016, 1 463:49-59.

[36] 周炜, 陈慧华, 应永飞, 等. 高效液相色谱-四级杆/线性离子阱质谱法筛查兽药中非法添加物的研究[C]. 中国兽药杂志, 2014.

[37] FREITAS A, BARBOSA J, RAMOS F. Multi-residue and multi-class method for the determination of antibiotics in bovine muscle by ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Meat Science, 2014, 98(1): 58-64.

[38] XIA X, WANG Y, WANG X, et al. Validation of a method for simultaneous determination of nitroimidazoles, benzimidazoles and chloramphenicols in swine tissues by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2013, 1 292(5):96-103.

[39] 沃特世(WATERS). POSI±IVE SystemTM高通量快速筛查检测系统解决方案[J]. 食品安全导刊, 2009, 17(9):38-39.

[40] PETERS R J B, BOLCK Y J C, RUTGERS P, et al. Multi-residue screening of veterinary drugs in egg, fish and meat using high-resolution liquid chromatography accurate mass time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(46):8 206-8 216.

[41] 王海鉴. 使用TripleTOF4600进行未知物筛查[J]. 食品安全导刊, 2013(15): 39-40.

[42] DASENAKI M E, BLETSOU A A, KOULIS G A, et al. Qualitative multiresidue screening method for 143 veterinary drugs and pharmaceuticals in milk and fish tissue using liquid chromatography quadrupole-time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(18):4 493-4 508.

[43] JIA W, CHU X, LING Y, et al. High-throughput screening of pesticide and veterinary drug residues in baby food by liquid chromatography coupled to quadrupole Orbitrap mass spectrometry[J]. Journal of chromatography A, 2014, 1347(15):122-128.

[44] JUNZA A, BARBOSA S, CODONY M R, et al. Identification of metabolites and thermal transformation products of quinolones in raw cow′s milk by liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry[J]. Journal of agricultural and food chemistry, 2014, 62(8): 2 008-2 021.

[45] JUNZA A, DORIVAL-GARCA N, ZAFRA-GMEZ A, et al. Multiclass method for the determination of quinolones and β-lactams, in raw cow milk using dispersive liquid-liquid microextraction and ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2014, 1356:10-22.

Recent development in multi-residue determination of drugs in animal derived food by ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry research

YIN Zhi-qiang, SONG Yue, CHAI Ting-ting, WANG Xin-lu, JIA Qi, YANG Shu-ming, QIU Jing*

(Institute of Quality Standards & Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences; Key Laboratory of Agri-food Quality and Safety, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China)

In order to screen and monitor the residue of veterinary drugs and therapeutic drugs in animal processed food, high-performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) has become the most widely method used in the field in trace detection. The research progress of sample preparation, latest research topics, evaluation of matrix effects, and selection of the mass spectrometer were introduced. At the same time, the development prospects of this application was also discussed. This paper is to provide a reference to related research in the future.

high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS); animal derived food; veterinary drugs; residue; screening; review

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704045

硕士研究生(邱静研究员为通讯作者，E-mail：qiujing@caas.cn)。

本文系公益性农业行业科研专项“动物养殖中新型未知添加物筛查与确认技术研究与示范(201203023)”资助

2016-07-23，改回日期：2016-10-10