储藏条件和种子粒径对天师栗种子生活力的影响研究

明孟碟，熊 超，胡志刚，杨红兵，郑国华，石召华，徐 雷*

(1.湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065；2.武汉爱民制药股份有限公司，湖北 鄂州 436070)

储藏条件和种子粒径对天师栗种子生活力的影响研究

明孟碟1，熊 超1，胡志刚1，杨红兵1，郑国华1，石召华2，徐 雷1*

(1.湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065；2.武汉爱民制药股份有限公司，湖北 鄂州 436070)

通过探索天师栗种子的适宜储藏条件及播种种子粒径，以提高种子生活力，节约种子繁殖过程中种子用量。采用二因素多水平试验设计，筛选TTC染色法测定天师栗种子生活力的最佳TTC浓度和染色时间，同时运用TTC染色法对不同储藏条件下不同粒径的天师栗种子生活力进行比较研究。结果表明，TTC染色法测定天师栗种子生活力的最佳条件为：0.20%浓度的TTC溶液染色11～13 h；沙藏方式储藏的种子生活力较其它方式均高，达85.30%，并且差异达到显著水平；大粒径种子(φ≥4.5 cm)和中粒径种子(3.0 cm≤φ<4.5 cm)的生活力比小粒径种子(φ<3.0 cm)生活力高。故在天师栗种子繁殖过程中，宜采用沙藏方式储藏，并选用较大粒径种子(φ≥3.0 cm)。

天师栗；种子；储藏条件；粒径；TTC染色法；生活力

0 引言

天师栗(AesculuswilsoniiRehd.)为无患子目(Sapindales)七叶树科(Hippocastanaceae)七叶树属(AesculusLinn.)的落叶乔木，是我国特有的珍稀树种。其干燥种子为《中国药典》收载的 “娑罗子”药材的主要来源之一，具有疏肝理气、和胃止痛的功效，用于治疗肝胃气滞、胸腹胀闷、胃脘疼痛等[1]。娑罗子含有皂苷类、有机酸、脂肪酸、多糖[2]等多种化学成分，七叶皂苷为其主要活性成分。现代药理学研究表明七叶皂苷具有抗炎、抗渗出、抗脑水肿、抗肿瘤、增加静脉张力、保护大脑缺血性损伤、保护胃肠道的功效[3]。近年来，以七叶皂苷钠为主要有效成分的冻干粉针剂、搽剂、片剂、胶囊等被广泛应用于临床，产业规模高达20亿元[4]。同时由于娑罗子在去油脂、抗氧抗衰老、消浮肿等方面的独特疗效，以其药材为原料开发的美容、美体等系列产品亦展现出广阔的市场应用前景。此外，由于娑罗树作为著名的观赏树种和佛教所赋予的“圣树”寓意，其在作为绿化园林建设行业行道树和旅游开发等方面也具有较好的综合开发前景。

近年来，市场对娑罗子药材需求量逐年增加，野生资源远不能满足药用需求，当前其药材主要源自人工栽培[5]。野生天师栗分布于海拔1000～1800 m的阔叶林中，主产于湖北西部、河南西南部、湖南、江西西部、广东北部、四川、贵州和云南东北部等地区，通过分根、扦插及种子等方式进行繁殖，生产实践中以种子繁殖为主。种子繁殖虽然繁殖系数大，操作简单，但存在存活率低、种子投入成本高、播种期短、越冬易冻苗等问题。研究还表明天师栗种子属顽拗性种子[6]，极易失活,不易保存,所以提高天师栗种子的生活力，既对生产实践中指导种子繁殖具有重要意义，亦能缓解种子用于育苗和入药间的矛盾，从而提高经济效益。基于此，本试验通过TTC染色法对天师栗种子生活力的适宜测定条件进行了筛选，并对不同储藏条件下不同粒径的天师栗种子生活力进行了比较研究，以期为实现科学化、规范化种植和资源的合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试天师栗种子于2015年9月采自湖北省竹溪县湖北神农爱民药业有限公司娑罗子规范化种植示范基地，经湖北中医药大学杨红兵教授鉴定为七叶树科七叶树属植物天师栗(A.wilsoniiRehd.)的种子。

1.2 试验方法

1.2.1 种子采集与储藏 选取生长健壮、无病虫害的成年植株，采集其成熟后自然脱落的蒴果，除去果皮后随机分为A、B两组，A组用于TTC染色法最佳染色条件的选择，B组用于不同储藏条件下种子生活力测定。

1.2.2 种子染色及观察鉴定 天师栗种子室温浸种24 h后，剥去种皮，然后沿种胚纵切，置于培养皿中，加入用磷酸缓冲液配制的TTC (2 ,3, 5-氯化三苯基四氮唑)溶液至种子被完全浸没[7]，于30 ℃恒温培养箱中避光染色，染色结束后，取出种子并用自来水冲洗，观察、记录并统计种子的生活力。

根据种子染色的部位和染色程度判断种子的生活力情况。凡是胚被染成鲜红色的为活种子；胚的主要结构胚根不染色或者营养组织不染色或为灰白色，组织异常，如软化腐烂、虫蛀、损伤等，均为无活力的种子；腐烂的为死亡种子[8-9]。

1.2.3 TTC染色法最佳染色条件的选择 采用二因素随机区组试验，筛选最佳的TTC浓度(c)和染色时间(t)。设置TTC浓度为0.05%(c1)、0.20%(c2)、0.50%(c3)；设置染色时间为9(t1)、11(t2)、13(t3)h，共9个处理。每次处理均重复3次，每次重复30粒种子。

1.2.4 不同储藏条件下天师栗种子生活力测定 将B组种子采用-20 ℃、-80 ℃、沙藏(保持湿度层积处理)3种贮藏条件储藏至翌春3月，按照1.2.2所示试验方法和1.2.3所确定的TTC染色法最佳染色条件对种子进行生活力检测。每种储藏条件均重复4次，每次重复34粒种子。

1.2.5 数据处理 统计胚完全染色有生活力种子的个数，计算百分率；采用SPSS 19.0软件进行方差分析，用Duncan’s法进行多重比较，P< 0.05差异显著，P< 0.01差异极显著。

2 结果与分析

2.1 TTC染色法最佳染色条件的选择

不同TTC浓度和染色时间处理的天师栗种子生活力的方差分析结果表明，处理组合、TTC浓度和染色时间对天师栗种子生活力测定结果均有显著性影响(P< 0.05)(表1)。不同TTC浓度和染色时间组合协同处理的种子生活力的比较，结果见表2，显示c2t3组合处理下天师栗种子生活力最高，达到94.44%；其次为c2t2处理组合(83.33%)；最低处理组合为c1t3，生活力为48.89%。

表1 TTC浓度和染色时间对天师栗种子生活力的方差分析

同一染色时间不同TTC浓度对天师栗种子生活力影响的多重比较结果见表3。在不同染色时间下均以c2(0.20%)处理的种子生活力最高，且表现为c2(0.20%)处理下种子生活力高于c3(0.50%)处理高于c1(0.05%)处理。不同TTC浓度以c2(0.20%)处理下天师栗种子生活力最高，达到86.67%，与c1、c3存在显著差异，且三者间存在极显著性差异(P<0.01)(表4)。

同一TTC浓度不同染色时间对天师栗种子生活力影响的多重比较结果见表5。结果表明：c2、c3条件下t3(13 h)处理的种子生活力均最高；c1条件下t2(11 h)处理的种子生活力最高，c3处理的种子生活力最低。不同染色时间对天师栗种子生活力影响的比较，结果见表6。t2(11 h)处理下天师栗种子生活力最高，但与t3没有显著性差异，与t1之间差异达到显著水平(P< 0.05)，表明在TTC染色处理过程中，随着时间的延长，TTC与种子生活细胞中的脱氢酶逐渐反应，当达到11 h以上时反应趋于完全。因此，TTC染色法测定天师栗种子生活力的最佳条件为：TTC浓度为0.20%，染色处理11～13 h。

2.2 不同储藏条件下天师栗种子生活力测定

不同储藏条件处理的天师栗种子生活力的方差分析结果见表7。结果表明不同储藏条件对天师栗种子生活力有显著性影响(P< 0.05)。不同储藏条件处理下天师栗种子生活力的多重比较详见表8。结果表明：沙藏条件下天师栗种子生活力最高，达到85.30%；-20 ℃与-80 ℃储藏条件下天师栗种子生活力没有显著性差异，但与沙藏条件下的存在显著性差异，且较沙藏条件下的显著降低。

表2 TTC浓度和染色时间对天师栗种子生活力的影响

表3 同一染色时间不同TTC浓度对天师栗种子生活力影响的多重比较

结果显示低温储藏的天师栗种子生活力比沙藏处理的种子生活力低，可能与其种子顽拗性、不耐脱水和对低温敏感有关。对于顽拗性种子而言，较高自由水含量可能是保障其生活力的重要条件，低温储藏的种子在缓慢降温的过程中，水分首先在胞间隙形成冰晶，并引起胞内自由水向胞间隙迁移，随着温度的继续下降，胞内水分亦形成冰晶，同时在低温环境下细胞活性氧增加而发生膜脂过氧化作用，导致膜的结构和功能受损，进而导致种子生活力逐渐丧失。

表4 不同TTC浓度处理的天师栗种子生活力的多重比较

表5 同一TTC浓度不同染色时间对天师栗种子生活力影响的多重比较

表6 不同染色时间处理的天师栗种子生活力的多重比较

2.3 不同储藏条件下种子粒径对天师栗种子生活力的影响

种子处理后逐粒测量其直径(φ)，按大粒种子(φ≥4.5 cm)、中粒种子(3.0 cm≤φ<4.5 cm)、小粒种子(φ<3.0 cm)进行分级，将3种不同粒径的种子分别于-20 ℃、-80 ℃、沙藏3种储藏条件下储藏。各级种子生活力结果详见图1。结果表明不同粒径种子生活力差异较大，不同储藏条件下均表现为大粒及中粒种子生活力较强，小粒种子生活力较弱。

表7 不同储藏方式下天师栗种子生活力的方差分析

和小粒径种子相比，大粒径种子表面积与体积之比小，水分散失慢；同时种胚体积大，种子内贮藏的营养物质亦更多，因此在同等条件下，大粒径种子更能维持种胚活力，保障种子生活力。种子萌发后，较大粒径种子所贮藏的淀粉、蛋白质等营养物质能更充分地满足种子萌发所需的营养要求，因而比小粒径种子表现出更强的抗逆性。故在种子繁殖过程中，宜选用较大粒径种子(φ≥3.0 cm)。

表8 不同储藏方式处理的天师栗种子生活力的多重比较

图1 不同储藏条件下不同粒径对天师栗种子生活力的影响

3 结论与讨论

TTC染色法是目前国际上公认较好的测定种子生活力的方法，被广泛应用于农作物和药用植物等种子生活力的测定[10]。研究表明浸种温度、浸种时间、TTC浓度、染色温度、染色时间以及不同影响因素的组合对种子生活力的测定结果均有影响[11-12]，且不同植物间存在较大的差异，因此对于不同物种，需针对性地确定适宜的测定条件。本研究探索了TTC浓度和染色时间对天师栗种子生活力的影响，结果表明TTC浓度、染色时间以及两者的不同组合对其生活力均有显著性影响，TTC染色法测定天师栗种子生活力的最佳条件为：TTC浓度为0.20%，染色处理11～13 h。通过不同TTC浓度和染色时间的多重比较分析，不同TTC浓度间的种子生活力差异较不同染色时间间的差异更显著，表明TTC浓度对天师栗种子生活力测定更为关键。

种子是显花植物自然繁殖的主要载体，适宜的储藏条件是决定其在下一生活周期起始时能否正常萌发的重要因素。天师栗种子具有顽拗性，不易储藏，研究结果表明不同储藏条件以及不同粒径的天师栗种子生活力呈现较大差异，选用较大粒径种子(φ≥3.0 cm)并进行沙藏为宜。同时沙藏过程中需维持适宜的温度和湿度，温度过高时种子易提前萌发导致不能正常越冬，湿度过大时种子易霉变，而温度及湿度过低都会不同程度引起种子的生活力下降。

种子储藏是种质资源研究的重要内容，当前随着国家药用植物种质资源库的建立，种子储藏研究的重要性进一步凸显。结合植物生理学、遗传学、植物化学、分子生物学等多学科技术手段，对种质资源进行研究，既能促进资源的保护，又能充分挖掘利用资源，实现资源的可持续利用。沙藏方式适宜短期的储藏，在实际生产中简便适用。如何长期保存并进行种质资源研究，对娑罗子药材的可持续利用及其产业链的构建具有重要意义。同时，天师栗种子作为中药“娑罗子”的基原之一，在储藏期间对其临床药用物质基础的内在药效成分的变化规律亦有待深入研究。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2015:292-293.

[2] 尉芹,马希汉,张强,等.娑罗子化学成分研究进展[J].西北林学院学报,2003,18(4):126-129.

[3] 李珊,马玲云,魏锋,等.中药娑罗子的现代研究进展[J].亚太传统医药,2012,8(8):178-181.

[4] 王绪英,赵永芳.中药娑罗子的化学组分及七叶皂苷药用价值的研究[J].唐山师范学院学报,2001,23(5):7-11.

[5] 张辰露,李新生,梁宗锁.七叶树属植物的分布特征及化学成分研究进展[J].西北林学院学报,2009,24(6):142-145.

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[7] 国际种子检验协会(ISTA).1996国际种子检验规程[M].北京:中国农业出版社,1999.

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[9] 谢小龙,熊辉岩,王莉,等.四唑染色法测定唐古特大黄种子生活力的研究[J].种子,2013,32(5):117-118,122.

[10] 石磊,徐广灿,杨红兵.四唑染色法测定厚朴种子生活力的条件研究[J].安徽农业科学,2013,41(13):5607,5730.

[11] 何伶俐,易休,陈科力,等.四唑染色法测定白花前胡种子生活力方法研究[J].湖北农业科学,2011,50(18):3775-3777.

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(责任编辑：许晶晶)

Study on Effects of Storage Condition and Seed Size on Seed Viability ofAesculuswilsonii

MING Meng-die1, XIONG Chao1, HU Zhi-gang1, YANG Hong-bing1, ZHENG Guo-hua1, SHI Zhao-hua2, XU Lei1*

(1. College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China; 2. Wuhan Aimin Pharmaceutical Limited Company, Ezhou 436070, China)

In order to improve the seed viability ofAesculuswilsoniiand to save its seed usage during seed propagation, the author studied the optimum conditions for its storage and the suitable seed size for its sowing through adopting two-factor and multi-level experiment design. The best TTC concentration and dyeing time for the determination of seed viability ofA.wilsoniiby using TTC method were screened, and the viabilities of different sizes ofA.wilsoniiseeds under various storage conditions were compared. The results showed that the optimal determination condition for the seed viability ofA.wilsoniiwas staining for 11～13 h with 0.2% TTC solution. The viability ofA.wilsoniiseeds under sand-storage condition was the highest (85.30%), and it was significantly higher than that under other storage conditions. The large size of seeds (grain diameter φ≥4.5 cm) and middle size of seeds (3.0 cm≤φ<4.5 cm) had a higher viability than the small size of seeds (φ<3.0 cm). Therefore, in the process of seed propagation ofA.wilsonii, the larger size of seeds (φ≥3.0 cm) should be used and they should be stored in sand.

Aesculuswilsonii; Seed; Storage condition; Seed size; TTC method; Viability

2016-12-07

国家中医药管理局-湖北稀缺中药材种苗基地建设项目(2015-21)。

明孟碟(1991─)，女，湖北武汉人，硕士，研究方向为中药资源及其品质研究。*通讯作者：徐雷。

R282

A

1001-8581(2017)05-0053-04