双波长分光光度法测定化橘红中总黄酮的含量

李琼霞 黎晓欣 廖辉

【摘 要】 目的：建立一种测定化橘红中的总黄酮含量时能有效消去样品溶液背景干扰的方法。方法：甲醇超声提取总黄酮；最大吸收波长283nm为测定波长，325nm为参比波长，双波长分光光度法测定总黄酮含量。结果：标准曲线在0～80μg浓度范围内线性关系良好，相关系数r=0.9999；方法稳定性在0～120min良好，RSD%为1.1%；三个浓度水平加样回收率在98%～103%之间。结论：本方法简单易行，适用于化橘红产品的质量控制。

【关键词】 双波长分光光度法；化橘红总黄酮；含量测定

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2017）09-0011-03

Determination of Total Flavonoids in Exocarpium Citri Grandis By Double-wavelength Spectrophotometry

LI Qiongxia1 LI Xiaoxin1 LIAO Hui2

1.Guangzhou Yuexiu District Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou 510055，China；2.Foshan Ziyunxuan Pharmaceutical Co.，Ltd，Foshan 528000，China

Abstract：Objective To establish a method for the determination of the total flavonoids content in exocarpium citri grandis and can effectively eliminate the sample solution background interference.Methods The total flavonoids were extracted by ultrasonic method in Methanol. The maximum absorption wavelength was 283nm， the wavelength was 325nm， the content of total flavonoids was determined by standard curve method.Results The calibration curve was linear in the concentration range of 0～80μg， the correlation coefficient was 0.9999.The stability of the method was good at 0～120min and RSD% was 1.1%.The recoveries of the three levels were 98～103% .Conclusion The method is simple and can be used for the quality control of the exocarpium citri grandis.

Keywords：Double-wavelength Spectrophotometry；total flavonoids in exocarpium citri grandis；Content determination

化橘红为芸香科植物化州柚Citus grandis‘to-mentosa或柚Citus grandis （L.）Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮。在化州地区，按照化州柚植物形态和果实形态化橘红被分为正毛果和副毛果等类别[1]。正毛果为正毛橘红树果实，其形状球形，多心室，幼果密披绒毛；副毛果為副毛橘红树果实，其形状与正毛化州橘红差异不大，但果实的绒毛比正毛化州橘红少，香气稍淡，功效亦逊于正毛橘红果。黄酮类成分是化橘红的主要有效成分[2]，为准确测定化橘红中总黄酮的含量，本文选取两种化橘红果实正毛果和副毛果进行研究，前期研究中采用多种方法进行检测，发现很难消去样品中的背景干扰。总黄酮提取液组成复杂，而且提取过程中不可避免的带入样品中的天然色素等杂质成分，虽然经过分离，但其中仍含有很难分离的干扰性杂质，很大程度的影响了总黄酮含量的测定，笔者通过反复的试验摸索，发现用双波长分光光度法[2]测定样品中总黄酮的含量，能有效的消去杂质成分的干扰，为客观评价化橘红中总黄酮含量提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV-2550双光束紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；HN1006超声波清洗器（华南超声设备厂）；MILLIPORE超纯水机（密理博公司）；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 材料 柚皮苷对照品（批号：110722-201613，中国食品药品检定研究院，含量94.3%）；甲醇（分析纯）。化州平定镇和宝山镇两个产区的正毛果与副毛果，由佛山紫云轩药业采购提供。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取柚皮苷对照品8.43mg 置100mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，并加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL含柚皮苷84μg）。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取供试品约0.2g置离心管中，加8mL甲醇，超声60min，取出放冷，加甲醇稀释定容至10mL，摇匀滤过，精密吸取续滤液0.5mL至25mL比色管，加70%的甲醇定容至刻度。

2.2 测定波长的选择 用70%的甲醇做空白，分别对对照品溶液和供试品溶液在200～400nm范围内进行光谱扫描，对照品溶液和供试品溶液的光谱图基本一致，在283nm（±1nm）有最大吸收（如图1），但由于样品和对照品的等吸收点离样品最大吸收比较近，待测组分在此两点的吸光度差值不够大，因此选择样品右下侧的一段光谱曲线平缓、斜率变化较小的波长处作为参比波长，据此，选取最大吸收283nm作为测定总黄酮的测定波长，选择下端的吸收点325nm作为参比波长。

2.3 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0mL置10mL比色管中，用70%甲醇定容至刻度，摇匀，制成标准系列溶液。以70%甲醇为空白，于283nm、325nm处扫描测定吸光度，以浓度为横坐标，两点吸收差值为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为：y=0.02564x+0.00560，相关系数r=0.9999，表明对照品在0～80μg浓度范围内线性关系良好。

2.4 精密度考察 取同一份对照品溶液，照“2.3”项下方法连续测定6次，测得对照溶液平均浓度为39.48μg/mL，其RSD%为0.02% ，表明检测精密度良好。

2.5 稳定性考察 取同一份供试品溶液分别在0、10、30、60、90、120min按照“2.3”项下方法测定，结果总黄酮含量平均值4.50%，其RSD%为1.1%，表明供试品溶液在2h内稳定。

2.6 重复性考察 取同一批供试品，每份约0.2g，精密称定，按照供试品溶液制备方法平行制备样品，按照“2.3”项下方法测定吸光度，结果总黄酮含量平均值4.46%，其RSD%为2.0%，表明该方法有良好的重现性。

2.7 加样回收率试验 随机抽取两份供试品，每个样称三份，每份约0.2g，分别进行三个浓度水平加标，按照供试品溶液制备方法制备样品，按照“2.3”项下方法测定吸光度，结果如表1。测得加标回收率在98%～103%之间，其RSD%为1.8%，表明方法回收率高，准确度好。

2.8 樣品中总黄酮含量测定 取十批化橘红样品，按照供试品溶液制备方法制备样品，再按照2.3项下方法测定吸光度，计算供试液浓度C，然后按下式计算总黄酮含量。

总黄酮含量=（C×10×25/0.5）/（m×1000000）× 100%。

3 讨论

化橘红中的总黄酮主要以柚皮苷的形式存在，其含有多个酚羟基，受光照射或暴露在空气中，容易变色[3]，当用乙醇提取时，会将色素及其他一些组分一起提取出来，这些色素成分很难用石油醚提取除去，而且黄酮中的天然组成复杂而多样，难于完全分离，这种多组分混合溶液匹配的对照溶液也难找到，这些因素都会干扰比色测定，用单波长法测定结果很容易偏高。表2数据显示，用双波长分光光度法测定10份化橘红样品中总黄酮含量，结果正毛果中总黄酮含量总体高于副毛果，该方法很好的区分了化橘红两个不同品种的果实。试验结果表明：用双波长分光光度法测定化橘红中的总黄酮含量时，能很好的扣去样品提取液中的背景干扰，避免检测结果偏高的现象。该测定方法操作简单方便，方法准确性、重现性、线性关系、回收率均良好，在快速筛选优质化橘红类产品能发挥很好的作用。

参考文献

[1]李润唐，李映志，汪永保，等.中药“化橘红”原料植物化州柚种质资源初步研究[J].中国南方果树，2012，41（4）：53-55.

[2] 王雯，沈勇根，上官新晨，等.化橘红总黄酮纯化的工艺研究[J].食品工业科技，2013，34（7）：192-197.

[3] 陈云，封京京.双波长分光光度法测定油菜蜂蜜中总黄酮含量的研究[J].中国酿造，2016，35（2）：133-134.

（收稿日期：2017-03-07 编辑：陶希睿）