塞尼卡病毒A VP1基因遗传进化分析

杨彩娟 温肖会 任裕其 冼望强 刘暖华 谢乐新

摘要[目的]研究塞尼卡病毒A VP1基因的遗传变异情况。[方法]通过RT-PCR方法从广东省2个猪场的病料中扩增出塞尼卡病毒A阳性样品，并对其VP1基因进行了基因组扩增和序列分析。[结果]2个塞尼卡病毒A VP1基因与GenBank公布的巴西、美国、中国等毒株的同源性为92%～99%，与2002年美国分离株SVV-001的同源性分别为92.8%和92.7%，与我国分离株CH-02-2015、CH-03-2015、CH-04-2015的同源性最高达99.1%。通过序列分析发现，毒株VP1基因组存在散在突变点，表明毒株可能存在一定程度的变异。[结论]研究结果可为我国塞尼卡病毒A的深入研究和豬水疱样症状病的鉴别诊断提供参考。

关键词塞尼卡病毒A；PCR鉴定；VP1；遗传变异分析

中图分类号S855.3文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）26-0106-03

Phylogenetic Analysis of VP1 Gene of Senecavirus A

YANG Caijuan1，WEN Xiaohui2，REN Yuqi1，XIE Lexin1*et al

（1.The Supplies Reserve Center for Animal Disease Control and Prevention of Guangdong Province，Guangzhou，Guangdong 510520；2.Institute of Animal Health， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640）

Abstract[Objective]To study the genetic variation of senecavirus A VP1 gene.[Method]The positive samples of SVV in swine with vesicular symptom from two farms of Guangdong were amplified by RTPCR method.

The sequencing and phylogenetic analysis was made on Senecavirus A VP1.[Result]The homology between VP1 gene of these two strains and Brazil，USA and Chinese historical isolates on GenBank was 92%-99%.The homology between VP1 of these two strains and USA isolate SVV-001 in 2002 were 92.8% and 92.7% respectively. The highest homology of SVA VP1 gene with Chinese isolates CH-02-2015， CH-03-2015 and CH-04-2015 reached 99.1%.Sequencing analysis results showed that the VP1 gene existed scatter point，which suggested that the virus had evolved.[Conclusion]The research results can provide references for further study and differential diagnosis of SVA.

Key wordsSenecavirus A；PCR identification；VP1；Genetic variation analysis

塞尼卡病毒A（Senecavirus A，SVA），曾被稱为塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus，SVV），是无囊膜的单股正链 RNA 病毒，是小 RNA 病毒科（Picornaviridae）塞尼卡病毒属（Senecavirus）的唯一成员，与心肌炎病毒属遗传关系最近，可引起猪出现水疱性变化和新生仔猪死亡，成年猪感染通常呈亚临床感染，引起繁殖母猪和公猪鼻吻和冠状带、蹄部出现水疱样病变，偶见腹泻症状。1～3 日龄新生仔猪病死率可达 30%～70%[1] 。2014 年秋，巴西报道出现大量仔猪断奶前发病，1～4 日龄仔猪病死率达 30 %～70 %，送检病料排除了其他水疱性病毒病和细菌病，SVV 核酸阳性。截至 2015 年9 月底，美国已有 11 个州确诊猪只发生 SVV 感染[2]，而加拿大、意大利和巴西出现疑似 SVV 感染病例[2]。我国关于该病的首次报道是在2015年，并命名为 CH-01-2015，该病毒与其他 8株分离自加拿大、巴西和美国的 SVA 同源性高达 94.4%～97.1%[3]。尽管该病自身造成的损失有限，但由于该病与口蹄疫（FMD）、猪水疱病（SVD）、猪水疱疹（VES）及水疱性口炎（VS）极为相似，临床上很难区分。因此，应加强该病与上述疾病的鉴别诊断。 SVA基因组全长约7.2 kb，编码4个结构蛋白（VP1～4）和7个非结构蛋白（2 A～C，3 A～D）；4个结构蛋白的长度分别由265、286、241、74个残基组成[4]。其中， VP1 被公认为是小 RNA 病毒科免疫原性最强的蛋白[5]。笔者对实验室保存的有水疱样症状但口蹄疫、猪水疱病、猪水疱疹及水疱性口炎等4种病原检测结果呈阴性的病料样品进行了SVA核酸检测，并对检测到的2份阳性样品进行了SVA VP1基因扩增和分析，研究广东省猪场SVA VP1遗传演化情况，旨在为猪场水疱样症状病的综合防控提供试验依据。

1材料与方法

1.1病料样品临床病料样品为2016年下半年广东省茂名、博罗地区提供的口蹄疫、猪水疱病、猪水疱疹及水疱性口炎鉴定结果呈阴性的病猪内脏、水疱拭子等病料。

1.2主要试剂pMD18-T载体、病毒基因组RNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、DL2000 DNA Marker，均购自大连TaKaRa公司；小量质粒抽提试剂盒为U-gene公司产品。

1.3VP1基因扩增引物根据GenBank中收录的SVV-001（DQ641257）的基因组序列的VP1基因保守区设计PCR鉴定引物P1、P2，扩增目的片段为429 bp。根據GenBank中收录的SVV-001（DQ641257）的基因组序列VP1基因，设计SVA VP1全基因序列扩增引物，分别位于VP3和2A区域[6]，扩增目的片段大小为983 bp，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

SVA PCR扩增引物序列为：P1为5-GTTCCACTCCACCGACAA-3，P2为5- AAACCACCCTACAGCAAAT-3。SVA VP1全基因序列扩增引物序列为：SVA-1C556F为5- TCGGTTTACTCCGCTGATGGTTGG-3，SVA-2A22R为5-AGGACCAGGATTGGTCTCGATATC -3。

1.4病毒RT-PCR扩增及鉴定用病毒基因组RNA提取试剂盒从保存的水疱液中提取病毒基因组RNA。以基因组RNA为模板，以P1、P2为引物，进行目的片段的扩增。RT-PCR扩增过程（一步法）：25 μL的反应体系中，PrimeScript One Step Enzyme Mix 1 μL，2×One Step Buffer 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，Template RNA 2 μL，加RNase Free dH2O 补足25 μL。 PCR反应程序如下：50 ℃反转录30 min，94 ℃预变性5 min；94 ℃變性30 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循环35次； 72 ℃延伸7 min。同时，采用 RT-PCR 方法检测 FMDV、猪水疱病病毒（SVDV）、水疱性口炎病毒（VSV）、猪水疱疹病毒（VESV）、猪 2 型圆环病毒（PCV2）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）和猪轮状病毒，并设置阴性对照。将PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。将经胶回收纯化的 PCR 产物克隆至pMD19-T中，重组质粒由英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

1.5VP1基因的PCR扩增与克隆鉴定用病毒基因组RNA提取试剂盒从保存的水疱液中提取病毒基因组RNA。以基因组RNA为模板，以SVV-1C556F、SVV-2A22R为引物[6]，进行目的片段的扩增。RT-PCR反应体系（25 μL）：PrimeScript One Step Enzyme Mix 1 μL，2×One Step Buffer 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，Template RNA 2 μL，补RNase Free dH2O至25 μL。 PCR反应程序如下：50 ℃反转录30 min，94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共循环35次； 72 ℃延伸7 min。将PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。将经胶回收纯化的 PCR 产物克隆至pMD19-T中，重组质粒由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成测序。

1.6基因序列遗传进化分析应用NCBI网站的BLAST、生物学分析DNAStar、ClustalX 2 和 MEGA 6.0软件对扩增的核苷酸序列与 GenBank 中登录的 SVA的VP1基因序列进行同源性比对，绘制系统进化树，并将所测序列登录至 GenBank 数据库。

2结果与分析

2.1SVA的RT-PCR扩增鉴定结果

被检测的2份样本（L1、Q3）中均扩增显示阳性。扩增的目的片段大小约为430 bp，与预期大小相符，而其他猪病病毒及阴性对照扩增结果均为阴性（图1）。测序结果显示，L1与我国分离到的毒株SVA CH-02-2015（KX173339）、SVA CH-03-2015（KX17338）、SVA CH-04-2015（KX173340）相似性高，相似性在98%以上。因此，初步认定所扩增到的产物为SVA。

2.3VP1基因同源性及遗传进化分析

VP1基因序列比对结果（图3）表明，CH-GDZJ-2016、CH-GDBL-2016 的VP1基因与2002年美国分离株的SVV-001相比，同源性分别为92.8%和92.7%；CH-GDZJ-2016 的VP1基因与美国2015年的分离株USA/IA46008/2015/Passage 1、SVVA/USA/IA40381/2015_P1和SVVA/USA.IA40380/2015_P1的同源性分别为96.3%、96.7%和96.7%，CH-GDBL-2016与上述3个美国分离株的同源性分别为96.8%、97.3%和97.3%；CH-GDZJ-2016、CH-GDBL-2016 的VP1基因与我国2015年的分离株CH-01-2015相比，同源性为95.8%和95.9%；与CH-02-2015、CH-03-2015、CH-04-2015的同源性均在98%以上。CH-GDZJ-2016与巴西分离株BRA/UEL-SenV-B4/15 VP1、BRA/UEL-SVV-A1/15 VP1、BRA/UEL-SVV-B2/15 VP1和SVVA/BRA/UEL/SenV-E10/15 VP1的同源性分别为96.5%、96.5%、96.9%和96.7%，CH-GDBL-2016与以上4个巴西分离株的同源性分别为97.0%、97.0%、97.4%和97.2%。

從圖4可以看出，试验中鉴定的2个毒株与我国2015年分离的毒株CH-02-2015、CH-03-2015、CH-04-2015在一个小分支上，而与CH-01-2015属于不同的小分支，与美国2008年的分离株SVV-001存在较大差异。

3讨论与结论

SVA最初分离自细胞培养基[7]。2002年，由美国基因治疗公司在使用PER.C6细胞（转化的胎儿成视网膜细胞）培养腺病毒-5（Ad5）病毒载体时分离到塞尼卡病毒-001（SVV-001）[8]。此后的十多年内，美国兽医服务实验室（NVSL）从不同州的猪样品中分离到12株与SVV-001相似的病毒株[9]。目前，全世界范围内多个国家已经有关于该病的报道。2015年，我国首次报道有该病的发生。2016年，在广东省湛江、惠州地区一些猪场相继发生水疱性疾病，感染猪临床表现为跛行，嗜睡，鼻吻、口腔黏膜出现水疱，冠状带和蹄壁周围发红，出现溃疡性病变，短暂性发热，传播速度快，但未出现死亡病例，发病时间持续1～2周，经检测排除口蹄疫、猪水疱病、猪水疱疹、水疱性口炎等疾病。从病料中扩增出SVA病毒核酸阳性，经测序证实为SVA。

爱荷华州立大学兽医诊断实验室将 SVA毒株VP1和全基因组测序发现，所有的新分离毒株间的同源性高达为99%～100%，但与早期 SVA（1988—2001年）序列差异显著。美国 SVA 毒株与巴西 SVA毒株的同源性为97%～98%。进化树分析表明，近30 年来SVA已发生变异，致病性增强[10]。该试验中的2个毒株与2015年我国分离的CH-01-2015同源性较其与CH-02-2015、CH-03-2015、CH-04-2015毒株的同源性高，从进化树来看属于不同的小分支。它们与美国、巴西分离株在VP1基因上也都存在明显差异。这些变异会是否导致毒株致病性增强，还有待进一步研究。

SVA病毒大量存在于鼻吻、蹄冠等部位的水疱中，且在血清、粪便中也可检出该病毒，说明SVA病毒是一种泛嗜性病毒，可造成多系统性疾病[11]。虽然SVA不是一种新的病毒，但是短时间内可以引起大量的猪发生水疱性疾病是从未发生过的。 是否与SVA的致病性增强有关，应该引起足够重视。应加强对该病的致病机理、病原学特点、鉴别诊断和预防控制方法的进一步研究和探讨。

安徽农业科学2017年

参考文献

[1]

VANNUCCI F A，LINHARES D，CBARCELLOS D E S N，et al.Identification and complete genome of Seneca Valley virus in vesicular fluid and sera of pigs affected with idiopathic vesicular disease，Brazil[J].Transbound Emerg Dis，2015，62（6）：589-593.

[2] SINGH K，CORNER S，CLARK S G，et al.Seneca Valley virus and vesicular lesions in a pig with idiopathic vesicular disease[J].Vet Sci Technol，2012，3（6）：1-3.

[3] WU Q W，ZHAO X Y，CHEN Y S，et al.Complete genome sequence of Seneca Valley virus CH-01-2015 identified in China[J].Genome Announc，2016，4（1）：1509-1515.

[4] VENKATARAMAN S，REDDY S P，LOO J，et al.Structure of Seneca Valley virus-001：An oncolytic picornavirus representing a new genus[J].Structure，2008，16（10）：1555-1561.

[5] GIMENEZ-LIROLA L G，RADEMACHER C，LINHARES D，et al.Serological and molecular detection of Senecavirus a associated with an outbreak of swine idiopathic vesicular disease and neonatal mortality[J].J Clin Microbiol，2016，54（8）：2082-2089.

[6] KNOWLES N J，HALES L M，JONES B H，et al.Epidemiology of Seneca Valley virus：Identification and characterization of isolates from pigs in the United States[EB/OL].（2016-04-10）[2017-05-04].http：//www.europic.org.uk/Europic2006/posters/Knowles.svv.01.pdf.

[7] FALLAUX F J，BOUT A，VAN DER VELDE I，et al.New helper cells and matched early region 1deleted adenovirus vectors prevent generation of replicationcompetent adenoviruses [J].Hum Gene Ther，1998，9（13）：1909-1917.

[8]

HALES L M，KNOWLES N J，REDDY P S，et al.Complete genome sequence analysis of Seneca Valley virus-001，a novel oncolytic picornavirus[J].J GenVirol，2008，89（5）：1265-1275.

[9] KOPPERS-LALIC D，HOEBEN R C.Nonhuman viruses developed as therapeutic agent for use in humans[J].Rev Med Virol，2011，21 （4）：227-239.

[10] GUO B，RADEMACHER C，ZHENG Y，et al.Yoon Identification of novel Senecavirus a from pigs with vesicular disease in the US[C]//24th international pig veterinary society congress （IPVS）.[s.l.]：[s.n.]，2016：109.

[11] LEME R A，OLIVEIRA T E，ALCANTARA B K，et al.Clinical manifestations of Senecavirus a infection in neonatal pigs，Brazil，2015[J].Emerg Infect Dis，2016，22（7）：1238-1241.