H7亚型流感病毒通用及区分强弱毒RT-PCR方法的建立

蒋文明，彭 程，李金平，王素春，侯广宇，袁万哲，陈继明

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；

2. 河北农业大学动物医学院，河北保定 071001）

H7亚型流感病毒通用及区分强弱毒RT-PCR方法的建立

蒋文明1，彭 程1，李金平1，王素春1，侯广宇1，袁万哲2，陈继明1

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；

2. 河北农业大学动物医学院，河北保定 071001）

为建立可以区分H7亚型流感病毒强弱毒的方法，根椐Genbank和GISAID中H7病毒的HA基因序列，设计2条特异性引物，建立了扩增H7病毒HA裂解位点区域的通用RT-PCR方法。在此基础上，在裂解位点处设计1条引物，建立了可以区分H7强弱毒的RT-PCR方法。该方法对弱毒株可以扩增出约337 bp的片段，对强毒株可以扩增出约349 bp和227 bp的片段，对其他常见亚型流感病毒的RT-PCR扩增均为阴性。敏感性试验结果表明，该RT-PCR方法的检测下限为1 fg的H7N9病毒模板。该方法对10份实验室已鉴定好的H7N9病毒进行对比验证，两者的符合率为100%。试验结果表明，该方法具有特异、快速、敏感、准确的特点，可用于H7亚型流感病毒的快速检测，同时还可区分强弱毒，对H7N9病毒，尤其是高致病性病毒的早期诊断和有效防控可提供有效技术支撑。

流感病毒；H7N9；RT-PCR；强毒株

2013年3月发生的“H7N9事件”给家禽业带来了巨大的冲击和经济损失[1]，但病毒遗传信息和动物实验都证明家禽中分离的H7N9病毒对家禽是无致病力的。尽管如此，仍存在变异成高致病性毒株的风险。2017年以来，某些地区的家禽发生了H7N9高致病性流感疫情，说明某些家禽中的H7N9病毒已经从低致病性毒株变异为高致病性毒株。

及早发现H7N9病毒是切实保障养禽业健康发展的前提。因此，建立H7N9病毒强毒株的快速检测方法十分必要。虽然已有可同时鉴别H7亚型和N9亚型的双重RT-PCR方法[2]，但该方法不能对高致病性H7N9病毒做出诊断。本研究在此基础上，建立了一种新的RT-PCR方法，不仅可以扩增H7亚型流感病毒，还可以区分强毒株与弱毒株。

1 材料与方法

1.1 病毒

H7N9、H7N2、H7N3、H5N6、H9N2等亚型流感病毒均由本实验室分离保存。

1.2 主要试剂

QIAamp Viral RNA Mini Kit，购自Qiagen公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit、DL2000 Plus DNA Marker，购自Vazyme公司。

1.3 引物设计

根据GenBank和GISAID数据库中发表的序列，针对H7流感病毒基因序列保守区设计1对引物，使其能够扩增HA1、HA2裂解位点区域（表1）。同时，根据裂解位点处的核苷酸序列，设计1条引物，使其能够扩增H7强毒的HA基因。

1.4 H7通用RT-PCR方法的建立

根据QIAamp Viral RNA Mini Kit操作说明提取病毒RNA，用微量核酸分析仪测定病毒RNA含量。将RNA作10倍比稀释，取2.0 μL稀释后的RNA模板，加入到22.0 μL RT-PCR预混液中，包括：2 × RT-PCR Buffer 12.5 μL，引物H7F1/H7R1各1.0 μL（10 μmol/L），Enzyme Mix 1.25 μL，ddH2O 7.25 μL。RT-PCR反应条件为：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，然后进行35个循环（94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），最后72 ℃延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5 与行业标准中引物的比较

以10倍比稀释的RNA为模板，分别以引物H7F1/H7R1、H7F2/H7R2和H7F3/H7R3进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 区分H7强弱毒RT-PCR方法的建立及优化

以引物H7F1/H7R1/H7RQ进行扩增，对下游引物H7R1的终浓度分别设定为0.04、0.08、0.12、0.16和0.20 μmol/L，然后进行RT-PCR反应。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，确定最适引物浓度。

1.7 RT-PCR方法的特异性

利用优化的RT-PCR方法分别检测H7N2、H7N3、H7N9、H5N6、H9N2等常见亚型的流感病毒，检验该方法的特异性。

1.8 RT-PCR方法的敏感性

用微量核酸分析以上测定的H7N9病毒RNA含量，然后作10倍比稀释，利用优化的RT-PCR方法，对不同稀释度的RNA进行扩增，检验该方法的敏感性。

1.9 RT-PCR方法的准确性

利用建立的RT-PCR方法对实验室分离并已测序鉴定的10株H7N9病毒进行检测，检验该方法的准确性。

表1 扩增H7亚型的引物

2 结果

2.1 通用RT-PCR扩增结果

2.0%的琼脂糖凝胶电泳结果表明，H7F1/ H7R1引物可以从含有H7N9病毒的尿囊液中扩增得到H7亚型特异的基因片段，获得与预期片段大小相符的条带（图1）。敏感性试验结果表明，H7F1/H7R1引物对的检测下限为1 fg。

图1 H7亚型通用引物的敏感性试验

2.2 与行业标准的对比

2.0%的琼脂糖凝胶电泳结果表明，H7F2/ H7R2引物对的检测下限为10 fg，H7F3/H7R3引物对的检测下限为10 fg（图2）。

图2行业标准中H7亚型通用引物的敏感性试验

2.3 区分强弱毒RT-PCR方法的建立及优化

通过对下游引物H7R1的浓度优化，确定RTPCR中H7F1、H7RQ最佳引物浓度分别为0.4 μmol/L，H7R1最佳引物浓度为0.08 μmol/L（图3）。

2.4 RT-PCR方法的特异性

利用建立的双重RT-PCR方法，分别对H7N9、H7N2、H7N3、H5N6、H9N2、IBV、NDV、IBDV、ILTV等病毒进行检测，结果显示该方法只能扩增H7亚型的流感病毒，对其它亚型流感病毒和其他常见禽病病毒扩增均为阴性，且对SPF鸡胚扩增结果也为阴性（图4），表明该方法具有良好的特异性。

图3不同引物浓度对H7N9病毒RNA模板的扩增

图4 RT-PCR方法对不同亚型流感病毒RNA的扩增

2.5 RT-PCR方法的敏感性

将提取的RNA依次做10倍比稀释，每个稀释度取2 μL作为模板进行扩增。结果显示1 fg的H7N9可扩增出特异性条带（图5），说明该方法具有良好的敏感性。

图5 RT-PCR对不同浓度H7N9病毒RNA模板的扩增

2.6 RT-PCR方法的准确性

对实验室分离鉴定的10株H7N9病毒进行检测，结果显示，该双重RT-PCR方法均可以进行良好的扩增（图6），说明该方法具有良好的准确性。

图6 RT-PCR方法对实验室分离鉴定的H7N9病毒检测结果

3 讨论

随着病毒的进化，某些H7N9病毒已经从低致病性变异为高致病性毒株，对养禽业危害巨大。

2014年建立的同时检测H7亚型和N9亚型的双重RT-PCR方法，既可确定H7N9亚型流感病毒，也可鉴别单个H7亚型或N9亚型流感病毒。但该方法只能确定是否为H7亚型病毒，而不能确定是高致病性毒株还是低致病性毒株。本研究根据GenBank和GISAID数据库中发表的H7亚型病毒HA基因序列，针对HA基因序列保守区设计1对引物，使其能够扩增HA1、HA2裂解位点区域，a其可以作为H7亚型病毒的通用检测引物。对扩增产物进行测序分析，即可确定该病毒是否已发生变异。

为进一步更直观地对H7亚型高致病性病毒进行检测，根据裂解位点处的核苷酸序列，设计1条引物，使其能够扩增H7强毒的HA基因。这样，如果检测的是弱毒株，则该方法只能扩增出约337 bp的片段；如果检测的是强毒株，则能扩增出约349 bp和227 bp的片段。

敏感性试验结果表明，本方法最低能检出1 fg的H7N9病毒模板，证明该方法的敏感性较高。与行业标准《禽流感病毒RT-PCR检测方法》（NY/ T 772—2013）和（NY/T 772—2004）中的检测引物相比，敏感性更高，而且行业标准中的引物不能扩增HA裂解位点区域，即使扩增出H7片段，也不能通过测序等方法鉴定出强弱毒。

本研究建立的RT-PCR方法，对于H7病毒强毒株和弱毒株的检测均可出现与试验设计大小相符的条带，而对于其他亚型流感病毒的扩增结果均为阴性，表现出较好的特异性；样品符合性试验结果表明，该方法表现出较高的准确性。

本研究建立的区分H7亚型流感病毒强弱毒的RT-PCR检测方法，具有特异性强、敏感性高、操作简单等优点。在同一反应体系中，加入3条引物，即可通过电泳快速区分强弱毒，省时省力。如果反应体系中只加入上下游2条引物，则可以作为H7亚型病毒的通用检测方法，进一步对扩增产物进行测序，可以确定病毒的变异情况，即使病毒裂解位点进一步发生变异，该方法仍然可以有效扩增和进行下游信息分析。该方法不仅实现了对H7病毒的快速检测，同时还可区分强弱毒，对H7N9病毒，尤其是高致病性病毒的早期诊断和有效防控具有重要意义。

[1] 蒋文明. 从“H7N9禽流感”命名说开去[J]. 中国动物检疫，2014，8（31）：80-82.

[2] 蒋文明，李金平，于美芳，等. 双重RT-PCR快速检测H7N9流感病毒方法的建立[J]. 中国动物检疫，2015，32（5）：65-68.

[3] 农业部. 禽流感病毒RT-PCR检测方法：NY/T 772—2013 [S]. 北京：中国标准出版社，2014.

[4] 农业部. 禽流感病毒RT-PCR检测方法：NY/T 772—2004 [S]. 北京：中国标准出版社，2004.

（责任编辑：朱迪国）

Establishment of a General Method for Distinguishing Inf l uenza RT-PCR Virus from H7 Subtype and Distinguishing between Virulent and Attenuated Inf l uenza Viruses

Jiang Wenming1，Peng Cheng1，Li Jinping1，Wang Suchun1，Hou Guangyu1，Yuan Wanzhe2，Chen Jiming1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. College of Animal Medicine，Agriculture University of Hebei，Baoding，Hebei 071001）

In order to establish a method of distinguishing virulent and attenuated strains of H7 subtype inf l uenza virus rapidly，two specif i c primers were designed according to the conserved regions on the HA sequences of H7 subtype virus in Genbank and GISAID. On this basis，a reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）method was established for amplif i cating the region and spanning the cleavage site of HA. The attenuated strain can be amplif i ed to fragments measured about 337 bp，and can be amplif i ed to fragments measured about 349 bp and 227 bp for the virulent strain. The method was negative for RT-PCR amplif i cation of other common subtype inf l uenza viruses. Sensitivity test showed that the detection limit of the RT-PCR method was 1 fg for the H7N9 virus templates. With 10 H7N9 virus strains identif i ed in the laboratory，the coincidence rate was 100%. It was showed that the established RT-PCR method was specif i c，rapid，sensitive，and accurate，and it could be used for rapid detection of H7 subtype inf l uenza virus. It was used to distinguish virulent and attenuated strains，so to provide technical support for early diagnosis and effective prevention and control for H7N9 virus，especially highly pathogenic virus.

inf l uenza virus；H7N9；RT-PCR；virulent strains

S855.65

：A

：1005-944X（2017）06-0090-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.026

科技部科技基础性工作专项（2012FY111000）