冠心宁片对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究

胡 飞，戎亦骊，朱科燕，陆 红，陈 诚，陈民利，潘永明*

(1. 浙江中医药大学比较医学研究所，杭州 310053；2. 浙江省医疗器械检验院，杭州 310018)

研究报告

冠心宁片对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究

胡 飞1,2，戎亦骊1，朱科燕1，陆 红1，陈 诚1，陈民利1，潘永明1*

(1. 浙江中医药大学比较医学研究所，杭州 310053；2. 浙江省医疗器械检验院，杭州 310018)

目的 观察冠心宁片(GXNT)对心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)大鼠心肌梗死和心脏自主神经功能的影响。方法 SD大鼠70只，随机分为7组，即伪手术组、MI/RI组、GXNT 75 mg/kg，150 mg/kg，300 mg/kg，600 mg/kg剂量组和300 mg/kg 复方丹参片(DST)组，每组10只。所有大鼠均预防性经口灌胃给药7 d后，采用结扎大鼠左冠状动脉前降支法，建立MI/RI大鼠模型。期间记录大鼠心电图并分析心电图J点和心率变异性(HRV)指标，并用伊文思蓝(EB)和2,3,5-氯化三苯基四氮唑蓝(TTC)双重染色心肌并分析心肌梗死面积以及行HE染色观察心肌病理学改变，测定血浆乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)水平。结果 与MI/RI组比，冠心宁片组和复方丹参片组能明显减轻心肌梗死面积和抑制LDH和CK活性的升高(P< 0.05,P< 0.01)，并能降低再灌注期大鼠-J值和J点平均值(P< 0.05，P< 0.01)，显著提高HRV和血浆NO水平以及降低血浆MDA含量(P< 0.05，P< 0.01)，并能改善心肌组织病理。

结论 冠心宁片能减轻MI/RI大鼠心肌梗死，并能改善心脏自主神经功能。

冠心宁片；心肌缺血再灌注损伤；心脏自主神经功能；心肌梗死；大鼠

缺血性心肌病是导致全球死亡或致残的主要原因，尤其急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)[1]。恢复缺血心肌的血流是AMI最有效的临床治疗原则，这种治疗方式包括溶栓和血管成形术等。然而，发现缺血心肌的突然再灌注会加重心肌组织损伤，这种现象被称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI)，使得心室收缩功能障碍、心肌细胞损伤和心力衰竭，甚至诱发室性心律失常或心源性猝死[2]。MI/RI的发病机制十分复杂，还尚未完全阐明。已有研究表明，活性氧、钙超载、中性粒细胞浸润和细胞凋亡均参与MI/RI的发生。但近来发现AMI患者存在交感/副交感神经功能失调，心脏自主神经功能紊乱，主要表现为心脏迷走神经张力降低，交感神经张力增加，导致心率变异性(heart rate variability, HRV)降低，使得AMI患者发生恶性心律失常和心源性猝死的危险性增加[3]。可见，异常HRV与MI/RI诱发的心血管事件有一定的关联性。

冠心宁片(guanxinning tablets, GXNT)是由丹参和川芎两味中药经改进提取工艺而制成，被用于治疗冠心病和缺血性心肌病。本课题组前期研究表明，冠心宁片能提高AMI犬血清一氧化氮(NO)水平和扩张冠脉流量，改善血液粘滞性和血管内皮功能，并具有溶栓作用[4-6]。然而，冠心宁片对MI/RI后心肌梗死和心脏自主神经调控的影响均未见相关报道。为此，本研究基于MI/RI大鼠模型，观察冠心宁片对MI/RI大鼠心肌梗死和心脏自主神经功能影响，为冠心宁片用于治疗临床AMI提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠70只，体重100～120 g，5～6周龄。由上海斯莱克实验动物有限公司提供[SCXK (沪) 2012-0002]，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心[SYXK (浙) 2013-0184]，室温为21～22℃，相对湿度为40%～70%，饲喂全价营养颗粒饲料，自由饮水，按实验动物使用的“3R”原则予以人道主义关怀。

1.2 主要仪器及药物

冠心宁片(guanxinning tablet, GXNT)，橘黄色薄膜片剂，由正大青春宝药业有限公司研制，批号：160704；复方丹参片(compound danshen tablet，DST)，广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：L5A003；红四氮唑(TTC)，中国华东师范大学化工厂；伊文思蓝，国药集团化学试剂有限公司；肌酸激酶(CK)，中生北控生物科技股份有限公司生产；乳酸脱氢酶(LDH)，上海申能德赛诊断技术有限公司生产；丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)试剂盒均由南京建成生物工程研究所生产。7020全自动生化分析仪，日本日立公司；RM2245型徕卡石蜡切片机，美国徕卡公司；DU-800紫外/可见分光光度计，美国Beckman Coulter公司；LC-V9动物呼吸机，上海奥尔科特生物科技有限公司；无创生理信号遥测处理系统，法国EMKA公司。

1.3 分组与给药

所有大鼠适应性饲养2周后，按体重随机分为伪手术(Sham)组、心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)组，冠心宁片75、150、300、600 mg/kg剂量组，300 mg/kg复方丹参片组，每组10只。除伪手术和MI/RI组大鼠经口灌胃蒸馏水外，其余大鼠均连续7 d预防性给予相应的药物，给药体积为10 mL/kg。

1.4 实验方法

1.4.1 MI/RI大鼠模型的制备

图1 实验操作程序Fig.1 Schematic illustration depicting the experimental protocol

给药7 d末，各组大鼠术前禁食12 h并称重，麻醉前15 min经口灌胃给予相应的药物或溶剂，15 min后以3%戊巴比妥钠溶液(1.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定，用针形电极刺入四肢皮下，经EMKA无创生理信号遥测处理系统记录大鼠II导联心电图，然后行颈部正中切口，分离气管并插管，接ALC-V9呼吸机通气，频率为60次/min，呼吸比率为2∶1，潮气量为30 mL/kg。于胸骨左侧第4肋间切口，打开胸腔并暴露心脏，于左心耳与肺动脉圆锥之间的左冠状动脉(LAD)起始下方2～3 mm处，用6-0医用无损伤带线缝合针于左心耳下方进针，然后将缝合线穿于自制的冠脉阻断塑料管。伪手术组缝合线空置、不拉紧缝合线外，其它各组均在灌胃给药30 min时拉紧缝合线，以塑料管球端压迫结扎LAD 30 min，松结扎线，再灌注观察2 h(图1)。

1.4.2 心电图检测和HRV分析

分别记录各组II导联心电图，用ECG-AUTO 自动分析软件进行模块化分析大鼠心电图J点，统计再灌注期J点总和(-J)和平均值(Average of J point)；然后按文献[7]行HRV分析，时域指标包括RR间期的标准差(SDNN)、相邻RR间期差值平方和的均方根(RMSSD)，并设定每组数据为512个，重复样本时间为100 ms，行Hamming快速功率谱分析，获取极低频波谱VLF(0.003～0.20 Hz)、低频波谱LF(0.20～0.75 Hz)、高频波谱HF(0.75～3.0 Hz)和总功率(TP)，进行标准化计算LFnu、HFnu和平衡指数LF/HF比值。

1.4.3 血液生化指标和心肌梗死面积测定

再灌注损伤2 h后，取腹腔静脉血3 mL，用肝素抗凝后分离血浆，在日立7020全自动生化分析仪上测定血浆CK和LDH活性，并在DU-800紫外/可见分光光度计上测定血浆MDA和NO水平。取血结束后，向大鼠右心室注射5%伊文思蓝1 mL；待巩膜蓝染后从右心室注射10%氯化钾溶液使心脏骤停，取出心脏并置入2%琼脂糖PBS缓冲液2 min后，剔除右心室和左右心耳，并放入-20℃中冷冻20 min，然后每隔2 mm横断切成5片，置入1% TTC溶液中37℃孵育15 min。用数码扫描仪扫描心肌片，用Image-J图像分析软件分析非TTC染色的灰白色梗死区(INF)占TTC红染的危险区(AAR)的百分比，其中伊文思蓝染区域为非缺血区。

1.4.4 心肌组织病理学观察

取结扎线下的第2片心肌片置于10%福尔马林溶液中固定脱水，石蜡包埋，切片，常规HE染色，树脂封片，在光学显微镜下观察心肌组织病理形态学变化。

1.5 统计学方法

应用SPSS 19.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准误(±s)表示，多组间比较经ANOVA单因素方差分析，组间比较采用L-S-D检验，以P< 0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 冠心宁片对MI/RI大鼠心肌损伤的影响

与伪手术组比，MI/RI组INF/AAR比值、血浆LDH和CK活性均显著升高(P< 0.01)；与MI/RI组比，冠心宁片各剂量组和复方丹参片组能显著降低INF/AAR比值和血浆CK活性(P< 0.05，P< 0.01)；同时300、600 mg/kg冠心宁片组和复方丹参片组亦能明显降低血浆LDH活性(P< 0.05，P< 0.01)(图2)。

2.2 冠心宁片对MI/RI大鼠心电图J点的影响

与伪手术组比，MI/RI大鼠缺血期J点明显抬高，再灌注后J点虽有降低但仍高于伪手术组(P< 0.05，P< 0.01)。与MI/RI组比，冠心宁片各剂量组和复方丹参片组能不同程度地抑制缺血期和再灌注期J点的抬高；其中300、600 mg/kg冠心宁片组和复方丹参片组能显著降低再灌注期-J和J点平均值(P< 0.05，P< 0.01)(图3)。

注：心肌片经伊文思蓝-TTC双重染色(A)和INF/AAR比值(B)；血浆LDH活性(C)和CK活性(D)；与伪手术组比，ΔΔP < 0.01；与MI/RI组比，*P < 0.05，**P < 0.01。图2 冠心宁片对MI/RI大鼠心肌损伤的影响Note.Representative photomicrographs of heart sections stained by Evans blue and TTC in different treatment groups (A) and myocardial infarct size (INF) expressed as a percentage of the total ischemic-reperfused area-at-risk (AAR) (B); the activity of LDH (C) and CK (D) in the serum of rats subjected to MI/RI. ΔΔP < 0.01 vs sham group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs MI/RI group.Fig.2 Effect of GXNT on myocardial damage in MI/RI rats

注：不同时间点的J点(A)，再灌注期总J点(B)和J点平均值(C)；与伪手术组比，ΔΔP < 0.01；与MI/RI组比，*P < 0.05，**P < 0.01。图3 冠心宁片对MI/RI大鼠心电图J点的影响Note.J point at different time (A), -J (B) and average of J point (C) during reperfusion in rats subjected to MI/RI; ΔΔP < 0.01 vs sham group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs MI/RI group. Fig.3 Effects of GXNT on J point of electrocardiogram in MI/RI rats

注：伪手术组(A);MI/RI组(B);300 mg/kg复方丹参片组(C)和600 mg/kg冠心宁片组(D)的心率变异性功率谱分析图，LF为低频，HF为高频。图4 各组大鼠心率变异性功率谱分析图Note.Representative spectra of heart rate variability, in the frequency domain, from sham (A), MI/RI (B) and MI/RI rats treated with 300 mg/kg DST (C) or 600 mg/kg GXNT (D). LF, low frequency; HF, high frequency.Fig.4 Power spectra analysis of heart rate variability in each group

注：与伪手术组比，ΔΔP < 0.01；与MI/RI组比，*P < 0.05，**P < 0.01。图5 冠心宁片对MI/RI大鼠HRV的影响Note.ΔΔP < 0.01 vs sham group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs MI/RI group.Fig.5 Effect of GXNT on HRV in MI/RI rats

2.3 冠心宁片对MI/RI大鼠心率变异性的影响

与伪手术组比，MI/RI大鼠RR间期、SDNN、RMSSD、TP和HFnu均显著降低(P< 0.01)，LFnu和LF/HF比值明显升高(P< 0.01)；与MI/RI组比，复方丹参片组能明显升高HFnu和降低LF/HF比值(P< 0.05)，同时150、300和600 mg/kg冠心宁片组亦能显著升高SDNN、RMSSD、TP和HFnu(P< 0.05，P< 0.01)，降低LFnu和LF/HF比值(P< 0.05，P< 0.01)(图4和图5)。

2.4 冠心宁片对MI/RI大鼠血浆MDA含量和NO活性的影响

与伪手术组比，MI/RI大鼠血浆MDA含量明显升高(P< 0.05)，血浆NO活性则显著降低(P< 0.05)；与MI/RI组比，300、600 mg/kg冠心宁片组和复方丹参片组能显著降低血浆MDA含量和升高NO活性(P< 0.05，P< 0.01)(图6)。

注：血浆MDA含量(A)和NO活性(B)；与伪手术组比，ΔP < 0.05；与MI/RI组比，*P < 0.05，**P < 0.01。图6 冠心宁片对MI/RI大鼠血浆MDA含量和NO活性的影响Note.MDA content (A) and NO level (B) in the serum of rats subjected to MI/RI. ΔP < 0.05 vs sham group; *P< 0.05, **P < 0.01 vs MI/RI group.Fig.6 Effect of GXNT on serum MDA content and NO activity in MI/RI rats

2.5 心肌组织病理形态学变化

伪手术组心肌纤维排列整齐，细胞核正常，心肌间质无炎性细胞浸润；MI/RI组心肌纤维肿胀、紊乱、呈波浪样改变、部分心肌纤维断裂、细胞核有破裂、溶解消失现象，心肌间质有炎性细胞浸润，并可见局灶性坏死和出血；75、150 mg/kg冠心宁片组和复方丹参片组心肌纤维破坏虽有所减轻、但仍有肿胀、紊乱以及少量炎性细胞浸润，偶见局灶性出血；300、600 mg/kg冠心宁片组心肌纤维排列较为整齐，心肌间纤维轻度肿胀、细胞核大小均匀，有少量炎性细胞浸润(图7)。

注：(A)伪手术组；(B)MI/RI组；(C)300 mg/kg DST组；(D)75 mg/kg GXNT组；(E)150 mg/kg GXNT组；(F)300 mg/kg GXNT组；(G)600 mg/kg GXNT组。图7 各组心肌组织病理形态学观察(×200)Note. (A)Sham group；(B)MI/RI group；(C)300 mg/kg DST group；(D) 75 mg/kg GXNT treated group；(E)150mg/kg GXNT treated group；(F) 300 mg/kg GXNT treated group；(G)600 mg/kg GXNT treated group.Fig.7 Myocardial pathological morphological observation in each group

3 讨论

MI/RI的发生，可加重缺血心肌的损伤，甚至可引发AMI患者恶性心律失常和心源性猝死等严重后果，为了使AMI患者获得最大的益处，世界各国研究学者正在积极探索在MI/RI早期干预，从而预防或减轻MI/RI。近几十年来，传统中药在防治心脑血管疾病中已体现出较大的优势，如中药丹参、川芎等均被证实对MI/RI有一定的保护作用，并与抗炎、拮抗钙超载、抑制自由基反应和抗细胞凋亡等有关[8,9]。同样，本研究也证实经丹参和川芎提取工艺改进而制成的新制剂——冠心宁片也能明显减轻心肌梗死和抑制血浆心肌酶CK和LDH活性的释放，表明冠心宁片对MI/RI大鼠心肌损伤具有保护作用，这与冠心宁片对AMI犬的心肌保护作用较为一致[10]，提示冠心宁片可用于防治MI/RI的发生。

另外，MI/RI后发生的室性心律失常是AMI患者心源性猝死的主要原因，故一方面改善心肌的动作电位和兴奋性，另一方面有效平衡心脏自主神经调控功能，是影响MI/RI后心肌组织重构和电重构的关键环节，这也对防止室性心律失常发生具有十分重要的作用。HRV作为目前无创、敏感、并能客观评估心脏自主神经活动的一项可靠性指标，已被广泛用于预测心源性猝死或心血管事件的发生[11]。在本研究中发现MI/RI大鼠心电图J点出现明显升高，同时RR间期、SDNN、RMSSD和HFnu均出现明显降低，而LFnu和LF/HF比值则显著升高，提示MI/RI发生后出现HRV降低，这可能与心肌缺血或再灌注时期存在过度的交感神经兴奋有关，促进心肌组织重构和电重构，进而使得心室电的不稳定性和易感性增强，是导致心律失常发生率增加的主要因素。同时，本研究发现冠心宁片干预后能明显提高MI/RI大鼠的HRV，并能抑制MI/RI大鼠心电图J点的抬高，表明冠心宁片能抑制交感神经活性，改善MI/RI大鼠的心肌动作电位和兴奋性，有效纠正心脏自主神经调控功能的紊乱，从而改善心室电的稳定性和左心功能，防止心律失常的发生。

研究发现，氧化应激也可造成心肌细胞损伤，增加心肌细胞膜通透性而导致细胞水肿，同时也能影响细胞膜蛋白功能，使细胞膜离子交换出现受阻，引起细胞内钙超载，加速细胞凋亡或死亡，促进MI/RI发生[12,13]。MDA是心肌细胞内脂质过氧化反应重要的代谢产物，其含量的高低可反映其脂质过氧化和心肌损伤程度[14]；另外也有学者发现NO能对抗心肌细胞凋亡，对MI/RI也具有心肌保护作用[15]。在本研究中也发现MI/RI大鼠血浆MDA明显升高和NO活性显著降低，病理组织亦显示心肌纤维呈波浪样改变和肿胀，心肌间质有炎性细胞浸润，并可见局灶性坏死和出血，表明MI/RI大鼠自身存在明显的氧化应激状态和炎症反应；而给予冠心宁片后能明显降低血浆MDA含量和升高NO活性，并能改善MI/RI大鼠的心肌病理组织形态，进一步证实了冠心宁片具有抗脂质过氧化的作用，并能促进机体NO的释放，这也可能是冠心宁片保护MI/RI大鼠心肌损伤的作用机制之一。

综上所述，冠心宁片对MI/RI大鼠心肌损伤具有保护作用，其机制与扩张血管、降低心肌耗氧量，改善心肌缺血，抑制氧化应激反应[10]，保护MI/RI所致的心脏自主神经功能紊乱，提高HRV，从而减少恶性心律失常有关。

[1] Mozaffarian D, Mozaffarian D, Benjamin EJ,etal.Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics—2016 Update: A Report From the American Heart Association [J].Circulation, 2016, 133(4):447-454.

[2] Yellon DM, Hausenloy DJ. Myocardial reperfusion injury [J]. N Engl J Med, 2007, 357(11):1121-1135.

[3] 李宏才.丹参酮ⅡA联合潘南金对急性心肌梗死患者心功能及QT离散度和心率变异性的影响[J].中国实用医药, 2009, 4(24):132-133.

[4] 邹煜, 应华忠, 潘永明,等. 冠心宁片对犬急性心肌缺血时冠脉流量的影响[J]. 浙江中西医结合杂志, 2005, 15(8): 482-485.

[5] 陈民利, 寿旗扬, 潘永明,等.冠心宁片对气滞血瘀大鼠抗血小板聚集和保护血管内皮作用[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2005, 10(5):586-589.

[6] 王木兰, 潘永明, 金敏,等. 斑马鱼血栓模型的建立与冠心宁片的干预作用[J]. 中国实验动物学报, 2016, 24(4): 432-438.

[7] de Morais Sdel B, da Silva LE, Lataro RM,etal. Mesenchymal Stem Cells Improve Heart Rate Variability and Baroreflex Sensitivity in Rats with Chronic Heart Failure [J]. Stem Cells Dev, 2015, 24(18): 2181-2192.

[8] 季海刚, 司亮, 司晓晨, 等. 丹参对心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究进展[J]. 光明中医, 2006, 21(3):52-54.

[9] 饶李亮. 川芎对大鼠心肌缺血再灌注NF-κB的影响作用[J]. 广东微量元素科学, 2016, 23(7):10-13.

[10] 陈民利, 吕建敏, 潘永明,等. 冠心宁片对Beagle犬急性心肌缺血的作用[J]. 浙江中医药大学学报, 2005, 29(4):54-56.

[11] Zhang J, He S, Wang X,etal. Effect of trimetazidine on heart rate variability in elderly patients with acute coronary syndrome [J]. Pak J Med Sci, 2016, 32 (1):75-78.

[12] Pagliaro P, Moro F, Tullio F,etal. Cardioprotective pathways during reperfusion: focus on redox signaling and other modalities of cell signaling [J]. Antioxid Redox Signal, 2011, 14(5):833-850.

[13] Chai Y, Zhang DM, Lin YF. Activation of cGMP-dependent protein kinase stimulates cardiac ATP-sensitive potassium channels via a ROS/calmodulin/CaMKII signaling cascade [J]. PLoS One, 2011, 6(3):e18191.

[14] 徐明亮, 王丽丽, 李琳, 等.白鲜皮水提物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国实验动物学报, 2013, 21(1): 47-52.

[15] Razavi HM, Hamilton JA, Feng Q. Modulation of apoptosis by nitric oxide: implications in myocardial ischemia and heart failure [J]. Pharmacol Ther, 2005, 106(2): 147-162.

Study on the protective effect of Guanxinning Tablet on myocardial ischemia reperfusion injury in rats

HU Fei1,2, RONG Yi-li1, ZHU Ke-yan1, LU Hong1, CHEN Cheng1, CHEN Min-li1, PAN Yong-ming1*

(1. Institute of Comparative Medicine, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China; 2 Zhejiang Institute for the Control of Madical Device, Hangzhou 310018)

Objective To observe the effect of Guanxinning Tablet (GXNT) on myocardial infarction and cardiac autonomic nervous function in rats with myocardial ischemia reperfusion injury (MI/RI). Methods Seventy SD rats were divided into 7 groups randomly (n=10); the sham group, the MI/RI group, 75 mg/kg, 150 mg/kg, 300 mg/kg and 600 mg/kg GXNT groups and 300 mg/kg Compound Danshen Tablets (DST) group. All rats were administered orally for 7 days, and then the MI/RI model was made by ligating the left anterior descending branch of coronary artery in rats. The changes of electrocardiogram were recorded and the electrocardiogram of J points and heart rate variability (HRV) parameters were analyzed. At the end of reperfusion, the myocardial infarct size was measured by using Evans blue and tetrazolium chloride (TTC) double staining, and pathological changes of myocardium were observed by HE staining. The changes of serum lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (NO) levels were also detected. Results Compared with MI/RI group, GXNT and DST groups were significantly reduced myocardial infarct size and inhibited the rising of serum LDH and CK activities (P< 0.05,P< 0.01), and also reduced the total or average value of J point during reperfusion (P< 0.05,P< 0.01). Meanwhile, GXNT and DST groups were markedly increased HRV and serum NO level as well as decreased serum MDA content (P< 0.05,P< 0.01), and improved myocardial tissue pathology. Conclusions GXNT can reduce the myocardial infarction in rats with MI/RI, and also improve the cardiac autonomic nervous function.

Guanxinning Tablet; Myocardial ischemia reperfusion injury; Cardiac autonomic nervous function; Myocardial infarction; Rats

浙江中医药大学比较医学创新团队(XTD201301)。

胡飞(1988-)，男，硕士生，专业：药理学。E-mail: 335040880@qq.com

潘永明(1979-)，男，副研究员，研究方向：实验动物与比较医学。E-mail:pym918@126.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0076-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.017

2016-09-27