牛奶中氨基糖苷类药物残留胶体金免疫层析技术研究

武晋孝，王成

（山西省饲料兽药监察所，山西太原030027）

检测分析

牛奶中氨基糖苷类药物残留胶体金免疫层析技术研究

武晋孝，王成

（山西省饲料兽药监察所，山西太原030027）

为建立可同时检测牛奶中6种氨基糖苷类药物残留的胶体金免疫层析技术，本研究采用棋盘法筛选胶体金颗粒标记链霉素、庆大霉素及卡那霉素抗体的最佳pH值和最适抗体用量，将3种标记好的金标抗体按一定的比例混合冻干。实验结果表明：该多残留胶体金免疫试纸条对牛奶中链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、小诺霉素、卡那霉素和妥布霉素的cut-off值分别为50、50、20、20、50、50 ng/m L。牛奶样本无需前处理，同步检测这6种药物的时间在10m in以内。采用胶体金方法检测100份从全国不同区域采集的原奶样品，并用高效液相色谱（HPLC）方法进行鉴定，两种方法的检测结果基本一致，说明建立的胶体金免疫层析方法准确性高，可靠性好。

氨基糖苷类；链霉素；庆大霉素；卡那霉素；胶体金；牛奶

氨基糖苷类药物（AGs）主要包括链霉素（STR）、双氢链霉素（DHS）、庆大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）、新霉素（NEO）和大观霉素（SPE）等，具有抗菌谱广、使用方便和价格低廉等优势，临床上主要用于革兰氏阴性菌所引起的感染（Li等，2009）。AGs最常见的不良反应为耳毒性和肾毒性（宋飚，2014）。研究表明，长期高剂量接触此类抗生素可引起动物的蓄积毒性，并通过食物链对人类健康产生潜在的危害（高月等，2016）。因此，研究和制定出一套动物源性食品中AGs简单、快速、灵敏且可靠的残留快速检测方法对完善我国的食品安全监测体系具有非常重要的意义。目前国内外用于动物性食品中AGs残留检测的方法主要有微生物法（Grasmick等，1982）、薄层色谱法（Bhushan和Arora，2001）、毛细管电泳法（Lin等，2008）、免疫分析法（Jin等，2005；Loomans等，2003；Verheijen等，2000）和HPLC（赵静等，2015；钱疆等，2011；杨慧元等，2011；刘晓茂等，2008）等。目前，仪器方法的应用检测较多。仪器方法具有灵敏度高、特异性好、抗干扰性强等优点，但仪器方法成本高、前处理繁琐、且对操作人员有专业性要求，不适合现场大批量样本的快速筛选。胶体金免疫层析技术因具备前处理简单、操作人员无专业要求、检测结果可快速获得等优势，在动物源性食品安全检测领域备受青睐，近年来，更是向多残留、高通量、高灵敏度及定量检测方向发展。本研究的目的是为建立同时检测牛奶中6种常用的AGs多残留胶体金免疫层析方法，为动物性食品中AGs残留检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器链霉素、庆大霉素和卡那霉素抗原、抗体均由中国农业大学动物医学院药理与毒理实验室提供。链霉素（STR）、双氢链霉素（DHS）、庆大霉素（GEN）、小诺霉素（MIC）、卡那霉素（KAN）、妥布霉素（TOB）、新霉素（NEO）、大观霉素（SPE）、阿米卡星（AMI）均购自中国兽药监察所。牛血清白蛋白（BSA）、氯金酸、Tween-20、柠檬酸三钠、海藻糖、碳酸钾等均购自国药集团化学试剂有限公司。硝酸纤维素膜（NC膜），美国Millipore公司。吸水纸、PVC底板、滤血膜等购自上海金标公司。

智能磁力搅拌电热套（ZNCL-TS），河南百泽仪器有限公司；磁力搅拌器（IKA誖RCT basic），德国IKA集团；纯水设备，美国Millipore公司；高速冷冻离心机（Lynx 4000），德国Thermo Fisher Scientific公司；电子分析天平，天津德安特传感技术有限公司；XYZ 3060划膜仪，美国BioDot公司；斩切机ZQ2000、裁条机CT300，上海金标生物科技有限公司；冻干机，美国Millrock公司。

1.2 金标抗体的制备本研究采用方阵法确定胶体金标记STR、GEN和KAN抗体的最佳pH值和最适抗体用量（Li等，2015）。胶体金颗粒（40 nm）采用柠檬酸三钠还原法制备（Li等，2015）。将胶体金标记STR、GEN和KAN抗体的烧杯分别标注为1、2和3号。分别准确称量制备好的100 mL胶体金溶液倒入1、2和3号烧杯中，将各烧杯置于磁力搅拌器上，设置搅拌速度为600 r/min，分别在1、2和3号烧杯中加入2.4、1.6和3.2 mL 0.1 M K2CO3，然后在相应烧杯中分别加入40、20、60μg的STR、GEN和KAN抗体（抗体加入之前均用1、2和3号配方稀释液稀释至20mL），搅拌20min后，分别加入20%BSA（w/v）溶液各2mL，持续搅拌10min后，将各金标抗体溶液取出分装，然后4℃，12000 r/min离心20 min，弃掉上清，底部红色沉淀分别用0.02 M PB（5%海藻糖，0.5%BSA，0.5%吐温-20，0.03%procline-300，pH 7.4）悬溶至200 mL，超声充分溶解后，4℃冰箱放置备用。

1.3 金标抗体干燥方式的选择将悬溶好的金标STR、GEN和KAN抗体溶液取出，用三合一多残留胶体金试纸条进行调试，最终确定微孔中加入金标STR、GEN和KAN抗体溶液的比例为20μL∶20μL∶15μL，将三种金标抗体溶液按上述比例混合，每孔加入混合金标抗体溶液为55μL，分别放入冻干机中冷冻16 h或37℃鼓风干燥机中烘干16 h后取出，在湿度＜30%的环境中将干燥好的金标抗体微孔放入装有干燥剂的铝箔袋中，密封保存待用。

1.4 抗原包被条件的选择抗原包被浓度：经调试，最终确定STR、GEN和KAN抗原的包被浓度分别为0.2、0.2、0.5mg/mL，将三种抗原用合适的包被液稀释后，按一定的顺序喷涂在NC膜上，37℃干燥16 h，密封保存待用。

抗原包被液：本研究筛选了三种不同配方的抗原包被液，分别为0.02 M PB（pH 7.4）、0.02 M PBS（pH 7.4，0.15 M NaCL）和0.05 M CB（pH 9.6），研究使用不同的包被液对试纸条显色和灵敏度等的影响。

NC膜：本研究筛选了三种不同爬速的NC膜。分别为MDI 90，Millipore 135和Millipore 180，研究使用不同的NC膜对试纸条跑样速度、显色和灵敏度等的影响。

包被位置：本研究是将三个不同的抗原喷涂在同一个NC膜上，除质控线（C线）固定在最上面之外，三条检测线（T线）总共有6种位置组合，考察不同的位置组合对试纸条显色和灵敏度等的影响。

1.5 样品垫的选择样品垫材质：本研究筛选了三种不同的样品垫材质，分别为滤血膜（HG-2）和玻璃纤维素膜（SB08和8904），研究使用不同的样品垫对试纸条层析效果、显色和灵敏度等的影响。

样品垫处理液：本研究筛选了四种不同配方的样品垫处理液，研究使用不同配方处理的样品垫对试纸条层析效果、显色和灵敏度等的影响。

1.6 胶体金免疫层析技术参数确认

1.6.1 cut-off值按照上述确定的最佳条件，将喷涂好STR、GEN和KAN抗原以及羊抗鼠二抗的NC膜，处理好的样品垫（15 mm）、吸水纸（29 mm）分别组装在PVC底板上，组装示意图见图1（A）。将组装好的试纸条切割成4.5mm的成品，放入装有干燥剂的铝箔袋中，密封保存待用。

将STR、GEN和KAN工作标准溶液分别添加到牛奶样本中，其中，STR和KAN的添加浓度分别为0、20、30、40、50、60 ng/mL，GEN的添加浓度分别为0、5、10、15、20、25 ng/mL，分别取添加好的牛奶样本200μL加入金标抗体微孔中，轻轻来回吹打5～6次使金标抗体完全溶解，室温孵育3 min后，将试纸条垂直插入微孔中，反应5min后观察结果，检测结果见图1（B），将各T线显色完全消失的浓度定为试纸条检测各药物的cut-off值。

1.6.2 交叉反应分别将DHS、MIC、TOB、AMI、NEO和SPE标准品添加到空白牛奶中配制成不同浓度梯度的样品：1000、100、50、20、10、0 ng/mL，用试纸条检测其特异性。

图1 （A）胶体金试纸条组装示意图、（B）检测结果示意图

1.6.3 稳定性将三批多残留试纸条产品放入装有干燥剂的铝箔袋中密封保存，同时进行低温、加速和长期稳定性实验。低温稳定性实验的设置条件为：4℃冰箱15 d，湿度＞60%，检测时间点为第0、7天和第15天。加速稳定性实验的设置条件为：45℃烘箱15 d，湿度＞60%，检测时间点为第0、7天和第15天。长期稳定性实验的设置条件为：温度18～24℃，湿度＜30%，检测时间点为第0、3、6、9和12个月。观察三种条件下试纸条的显色强度和灵敏度变化。

1.7 实际样本检测从全国不同区域采集100份原奶样本，同时用胶体金方法和HPLC方法进行检测，对比两种方法的检测结果，验证胶体金方法的准确性与可靠性。HPLC方法是钱疆等（2011）建立的检测乳制品中9种氨基糖苷类药物残留的液相荧光法。

2 结果与分析

2.1 抗体稀释液对试纸条显色和灵敏度的影响本研究筛选了三种不同配方的抗体稀释液，分别为双蒸水、0.02 M PB和0.5%BSA，不同抗体稀释液对抗体用量、试纸条显色和灵敏度的影响见表1。

由表1可知，抗体稀释液选择0.5%BSA时，三种抗体用量最少，三条检测线的显色最好，灵敏度没有差异，说明抗体稀释液的pH值、离子强度和蛋白质含量对胶体金标记抗体的影响很大，可能与以上三个因素对抗体活性的影响有关。

2.2 金标抗体干燥方式对试纸条显色和灵敏度的影响本研究对比了冷冻和热处理干燥两种方式对金标抗体溶解难易程度、视觉效果、稳定性以及试纸条显色和灵敏度的影响。

由表2可知，两种不同的干燥方式对试纸条显色强度和灵敏度短期内影响不大，但冻干有利于金标抗体的溶解、视觉美感和稳定性。冷冻干燥与热处理干燥相比，具有以下优势：（1）冷冻干燥是在冻结的状态下干燥，体积几乎不变，蛋白质等可保持原来的结构，最大限度保证了生物制剂的活性；（2）冷冻干燥后的物质呈海绵状，疏松多孔，加水后溶解迅速且完全，可立即恢复原来的性状；（3）冷冻干燥可排除95%～99%的水分，干燥后的产品可长期保存不至于失活。

2.3 抗原包被液对试纸条显色和灵敏度的影响三种不同配方包被液对试纸条显色效果、灵敏度和稳定性的影响见表3。

由表3可知，三种抗原用0.05M CB（pH 9.6）包被，放置一段时间后NC膜均泛黄，严重影响试纸条的稳定性。STR和KAN抗原用0.02M PB（pH 7.4）包被后有扩散现象，加入0.15M NaCL以后扩散现象消失，因此，STR和KAN抗原均选择0.02M PBS（pH 7.4，0.15M NaCL）作为包被液，GEN抗原用含盐离子浓度的PB包被，疏水性太强导致T线显色太窄，因此，GEN抗原包被液选择0.02M PB（pH7.4）。

表1 抗体稀释液对抗体用量、试纸条显色强度和灵敏度的影响

表2 金标抗体干燥方式比较

表3 包被液对试纸条显色效果、灵敏度和稳定性的影响

三种不同NC膜对试纸条的影响见图2。

图2 NC膜对试纸条显色和灵敏度的影响

由图2可知，NC膜爬速越慢，抗原与NC膜的亲水性越强，T线条带越宽。NC膜爬速对试纸条显色强度和灵敏度影响不大，因此从视觉美感的角度，我们选择Millipore 135进行后续的实验。

本研究还考察了六种不同的抗原位置组合对试纸条显色和灵敏度的影响，结果表明，不同的位置组合对试纸条显色和灵敏度基本没有影响。这可能与我们检测的均是小分子物质有关，胶体金的粒径是40 nm，而NC膜的平均孔径大约是8μm，因而不会对金标抗体的层析产生空间位阻。

2.4 样品垫的材质及用不同处理液处理对试纸条显色和灵敏度的影响本研究筛选了三种不同的样品垫材质（滤血膜HG-2、SB08和8904），研究其对试纸条层析速度、显色和灵敏度的影响。因SB08和8904为玻璃纤维素膜，是一种疏水性材料，导致样品的层析速度很慢，严重影响金标抗体的释放，且没有完成整个层析过程就中断了。而滤血膜亲水性强，样品扩散速度快，且对蛋白质的吸附低，是POCT诊断行业中理想的样品垫材料选择。

四种不同配方的样品垫处理液对试纸条显色和灵敏度的影响见表4。

表4 样品垫处理液对试纸条显色和灵敏度的影响

由表4可知，配方4为最佳样品垫处理液，其配方为：0.02 M PB（pH 7.4，0.8%Tween-20）。样品垫处理液中表面活性剂的含量太低，则会影响金标抗体的释放以及在NC膜上的表现。

2.5 胶体金免疫层析技术参数确定

2.5.1 cut-off值多残留胶体金方法检测STR、GEN和KAN标准品添加系列浓度的牛奶样品结果见图3。由图3可知，本研究研制的胶体金免疫层析试纸条检测牛奶中STR、GEN和KAN的cut-off值分别为50、20、50 ng/mL。直接检测牛奶样本，同步检测这三种药物的时间＜10 min。

2.5.2 交叉反应试纸条检测其他AGs的交叉反应实验结果见表5。

由表5可知，该试纸条对DHS、MIC和TOB有较强的交叉反应，其cut-off值分别为50、20、50 ng/mL，对AMI、NEO和SPE基本无交叉反应。结果表明，本研究研制的试纸条可同时检测STR、DHS、GEN、MIC、KAN和TOB六种AGs。

图3 试纸条检测牛奶中STR、GEN和KAN的cut-off值

表5 试纸条交叉反应实验结果

2.5.3 稳定性将三批多残留胶体金试纸条产品同时进行低温、加速和长期稳定性实验。产品在低温或高温且湿度大的环境下放置15 d后，试纸条的显色强度由1000下降至843，变化范围＜20%，而STR、GEN和KAN的cut-off值基本不变，结果表明，试纸条抗低温和高温能力较强。产品在室温、干燥避光环境下保存12个月后，试纸条的显色由1000下降至825，变化范围＜20%，并且STR、GEN和KAN的cut-off值基本不变，长期稳定性实验结果表明，试纸条的保质期可达12个月。

2.6 实际样品检测为验证胶体金方法的准确性与可靠性，从全国不同区域采集100份原奶样本，同时用胶体金方法和HPLC-MS/MS方法进行检测。采用胶体金方法共检测出4份GEN阳性样本（编号分别为28、36、59和83），2份STR阳性样本（编号分别为65、77），未检测到样本中含KAN，胶体金试纸条的检测结果与HPLC的检测结果一致，说明本研究建立的多残留胶体金免疫层析方法未出现假阳性和假阴性，准确性高，可靠性好。

3 讨论

影响胶体金免疫层析方法灵敏度的因素有很多（Li等，2014），比如：胶体金粒径、抗体稀释液、胶体金标记抗体的最佳pH值和最适抗体用量、金标抗体复溶液、层析方式、样品前处理等等。抗体稀释液对试纸条显色和灵敏度的影响非常关键，目前报道最多的抗体稀释液成分为双蒸水或PB缓冲液（任文洁等，2015；Chen等，2008）。本研究在前人研究的基础上，采用0.5%BSA作为抗体稀释液，发现与双蒸水和PB缓冲液相比，不仅降低了抗体的消耗量，还可以起到增强显色和提高灵敏度的作用，这与李向梅（2016）的报道一致。可能与BSA作为惰性蛋白，可以保护目的蛋白的活性，并且具有分散胶体金颗粒骨架，维持胶体金的胶体稳定，同时消除非特异性反应的作用有关。

本研究是在同一个NC膜上包被三个不同的抗原，形成三条检测线，达到多残留检测的目的。因结构的相似度较高，STR、GEN和KAN抗体分别对DHS、MIC和TOB有较强的交叉反应，交叉反应率在90%以上。因此，本多残留胶体金试纸条可以同步检测六种常用的AGs。

本文还研究了三条检测线共六种位置组合对试纸条显色和灵敏度的影响。结果表明，三种抗原位置的任意调换不会影响各自的检测性能。这可能与我们检测的药物均为小分子物质，抗体分子质量一般在150 KDa，胶体金的粒径为40 nm，而抗原抗体发生反应的载体NC膜的平均孔径一般在8μm左右，因此对抗原抗体反应产生空间位阻的可能性较少，这与Li等（2015）的研究报道一致。

目前，国内外检测AGs的胶体金免疫层析方法报道较多。但本研究的优势为6种常用AGs的多残留检测，可以同时检测STR、DHS、GEN、MIC、KAN和TOB，并且同步检测这6种药物的时间在10min以内。

4 结论

本研究成功建立了可同时检测牛奶中6种常用AGs残留的胶体金免疫层析技术。该方法对STR、DHS、GEN、MIC、KAN和TOB的cut-off值分别为50、50、20、20、50、50 ng/mL，同步检测这6种药物的时间在10 min以内。采用胶体金方法与HPLC方法同时检测从全国不同区域采集的100份原奶样本，两者的检测结果一致，说明建立的胶体金方法准确性高，可靠性好。

[1]高月，王耀，胡骁飞，等.氨基糖苷类药物的危害及其检测方法研究进展[J].河南农业科学，2016，6：9～14.

[2]何方洋，万宇平，丁双阳，等.链霉素胶体金快速检测试纸条的研制[J].中国动物检疫，2008，5：29～31.

[3]李向梅，王战辉，肖希龙，等.同时检测牛奶中喹诺酮类和庆大霉素残留的胶体金免疫层析方法研究[J].中国农业科学，2014，19：3883～3889.

[4]李向梅.牛奶中四种大环内酯类药物残留免疫检测技术研究：[博士学位论文][D].北京：中国农业大学.2016.

[5]刘晓茂，赵淑军，张进杰，等.蜂蜜中链霉素与双氢链霉素残留量的液相色谱串联质谱法测定[J].分析测试学报，2008，12：1351～1354.

[6]农业部.动物源食品中兽药最高残留限量[S].农业部公告［2002］第235号，2002年12月24日.

[7]彭桂平，邓红枚，刘平，等.牛奶中庆大霉素胶体金试纸条检测方法的研究[J].山东畜牧兽医，2015，6：3～6.

[8]钱疆，余孔捷，陈健，等.液相荧光法检测乳制品中9种氨基糖苷类药物残留[J].福建分析测试，2011，3：13～17.

[9]任文洁，黄志兵，许杨，等.伏马菌素B1胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制[J].食品工业科技，2015，24：58～63.

[10]宋飚.氨基糖苷类药物的不良反应及合理用药措施[J].药物与人，2014，7：73.

[11]王丽哲，王丽丽，赵瑜，等.牛奶中庆大霉素半定量胶体金试纸条的研制[J].中国饲料，2013，20：16～18.

[12]杨慧元，杜玥，徐伟东.HPLC-MS/MS测定蜂蜜中氨基糖苷类药物残留[J].中国现代应用药学，2011，8：751～756.

[13]赵静，刘婷，蔡柏岩，等.HPLC法测定原料乳中庆大霉素残留的研究[J].食品研究与开发，2015，9：94～97.

[14]Beloglazova N V，Shmelin P S，Erem in S A.Sensitive Immunochem ical Approaches for Quantitative（FPIA）and Qualitative（Lateral Flow Tests）Determ ination of Gentam icin in M ilk[J].Talanta，2016，149：217～224.

[15]Bhushan R，Arora M.Separation of Am inoglycosides by Normal-and Reversed-Phase TLC[J].JPC-Journal of Planar Chromatography-M odern TLC，2001，14（6）：435～438

[16]Chen Y Q，Li X M，He L D，et al.Immunoassays for the Rapid Detection of Gentam icin and M icronom icin in Sw ine Muscle[J].Journal of Aoac International，2010，93（1）：335～342.

[17]Chen Y Q，Wang Z Q，W ang Z H，et al.Rapid Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Colloidal Gold Immunoassay for Kanam ycin and Tobramacin in Sw ine Tissues[J].Journal of Agricultural and Food Chem istry，2008，56（9）：2944～2952.

[18]Grasm ick C，Lecoustum ier A，Capolaghi B，et al.Rapid M icrobiological M ethod for the Determ ination of Am inoglycosides in Biological-Fluids[J]. Annales De Biologie Clinique，1982，40（4）：467～468.

[19]Jin Y，Jang JW，Han C H，et al.Development of Elisa and Immunochromatographic Assay for the Detection of Gentam icin[J].Journal of Agricultural and Food Chem istry.2005，53（20）：7639～7643.

[20]Jin Y，Jang JW，Han C H，et al.Development of Immunoassays for the Detection of Kanamycin in Veterinary Fields[J].Journal of Veterinary Science. 2006，7（2）：111～117.

[21]Li X，LiW，Yang Q，et al.Rapid and Quantitative Detection of Prostate Specific Antigen w ith a Quantum Dot Nanobeads-Based Immunochromatography Test Strip[J].AcsApplied M aterials&Interfaces，2014，6（9）：6406～6414.

[22]Li X，W en K，Chen Y，et al.Multiplex Immunogold Chromatographic Assay for Simultaneous Determ ination of M acrolide Antibiotics in Raw M ilk [J].Food AnalyticalM ethods，2015，8（9）：2368～2375.

[23]Li X.，Chen Y，Tang S，et al.Residue Depletion of Gentam icin in Sw ine Tissuesafter Intramuscular Adm inistration[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（16）：7356～7362.

[24]Lin Y F，W ang Y.C，Chang SY.Capillary Electrophoresisof Am inoglycosidesw ith Argon-Ion Laser-Induced Fluorescence Detection[J].Journal of Chromatography A，2008，1188（2）：331～333

[25]Loomans E，Van W iltenburg J，KoetsM，et al.Neam in as an Immunogen for the Development of a Generic Elisa Detecting Gentam icin，Kanamycin[J]. and Neomycin in M ilk.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（3）：587～593.

[26]Song B.Adverse Reactions and Rational Drug M easures of Am inoglycosides[J].Medicine&People，2014，7：73.（in chinese）

[27]Verheijen R，Osswald IK，Dietrich R，et al.Development of a One Step Strip Test for the Detection of（Dihydro）Streptomycin Residues in Raw M ilk [J].Food and Agricultural Immunology，2000，12（1）：31～40.

[28]W u JX，Zhang S E，Zhou X P.Monoclonal Antibody-Based Elisa and Colloidal Gold-Based Immunochromatographic Assay for Streptomycin Residue Detection in M ilk and Sw ine U rine[J].Journal of Zhejiang University-Science B，2010，11（1）：52～60.

A colloidal gold immunochromatographicmethod was developed for the simultaneous detection of 6 aminoglycosides residues inmilk.The optimum pH and amount of Abswhich colloidal gold labeled streptomycin（STR），gentamicin（GEN）and kanamycin（KAN）Abswere screened using checkerboardmethod.The 3 gold-labeled Absweremixed by a certain percentage and then lyophilized.The results showed that the cut-off value for STR，dihydrostreptomycin（DHS），GEN，micronomicin（MIC），KAN and tobramycin（TOB）were 50，50，20，20，50，50 ng/mL，respectively.Milk sample without pre-treatment，the synchronization detection time of 6 drugswere within 10 min.A total of 100 raw milk samples collected from different regions were detected by the colloidal gold method，with HPLCmethod for identification.The test results showed that the colloidal gold immunoassaymethod has high accuracy and good reliability.

aminoglycosides；streptomycin；gentamicin；kanamycin；colloidal gold；milk

S816.17

A

1004-3314（2017）06-0024-06

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170606