影响对叶百部碱纯化的主要因素及其工艺优化

贺艳慧，张 林，张朝凤，许翔鸿，张 勉

(中国药科大学 生药学研究室，江苏 南京 211198)

影响对叶百部碱纯化的主要因素及其工艺优化

贺艳慧，张 林，张朝凤，许翔鸿，张 勉*

(中国药科大学 生药学研究室，江苏 南京 211198)

目的：通过对影响对叶百部碱纯化因素的研究及优化，得到对叶百部碱的最佳纯化工艺。方法：在建立HPLC-ELSD法测定对叶百部碱含量的基础上，采用单因素实验考察不同pH值、萃取溶剂、萃取次数和结晶溶剂对叶百部碱分离纯化的影响，筛选最佳纯化条件。结果：对叶百部药材醇提物酸化离心后，取上清液碱化至pH 8左右，以萃取溶剂为石油醚-乙酸乙酯(1∶1)为萃取溶剂萃取1次得到总碱浸膏。总碱溶于甲醇中结晶得到纯度大于98%的柱状晶体。结论：本实验得到了一种快速高效获得对叶百部碱的方法。

对叶百部；对叶百部碱；工艺优化

对叶百部(StemonatuberosaLour.)为药典收载的中药百部的三大来源之一[1]。中医学认为，百部内服可治咳嗽；外用可杀虫止痒[2]。对叶百部碱(tuberostemonine)是对叶百部中的主要特征性成分[3]。现代药理研究表明，对叶百部碱具有镇咳、麻痹蠕虫运动性和抑制小龙虾神经肌肉接头兴奋传导的作用[4-6]。而传统分离对叶百部碱，都是通过硅胶柱层析的方法，容易造成生物碱的死吸附，使得率降低，无法大量获得对叶百部碱纯品。且从对叶百部中提取其主要成分对叶百部碱工艺过程的研究很少。本文对传统的纯化方法进行了改进和优化，得到一种快速高效获得对叶百部碱的方法，此方法也同样适用于百部中和对叶百部碱结构相似的生物碱。

1 材料与仪器

1.1 材料

对叶百部碱对照品，实验室自制，纯度大于 98%(HPLC)。对叶百部药材购自河北安国东方药城，经本人鉴定，中国药科大学生药学教研室张勉教授核对为百部科植物对叶百部(Stemona tuberosa Lour.)的干燥块根。甲醇、三乙胺为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

1.2 仪器

Agilent 1200 分析型液相色谱仪，Alltech 3300 ELSD 检测器；Sartorius 电子分析天平；KH-500DE 超声波清洗器。

2 方法与结果

2.1 对叶百部碱含量测定方法学考察

2.1.1 色谱条件 色谱柱 Agilent Extend C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.1%三乙胺水(B)，梯度洗脱(0～3 min，50%～58% A；3～19 min，58%～75% A)，进样量10 μl，流速1 mL/min；柱温30 ℃。漂移管温度 90 ℃，氮气流速为 2.2 L/min，增益为 8。

2.1.2 对照品溶液的制备 称取对叶百部碱约11.6 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解并稀释至刻度，超声，摇匀，即得1.16 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取对叶百部药材粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50 mL，超声提取 30 min，摇匀，滤过，将残渣用20 mL甲醇洗两遍，并入提取液，减压回收溶剂至干。残渣加少量色谱甲醇溶解，转移至 10 mL 量瓶中，加色谱甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 标准曲线的制备 取对叶百部碱对照品溶液加甲醇依次稀释为1.16、0.58、0.232、0.116、0.058和0.023 2 mg/mL，进样量10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。分别以峰面积(Y)的对数值为纵坐标，以对叶百部碱对照品浓度(X)对数值为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程lgY=1.642 LgX+4.599，对叶百部碱在 0.232～11.6 μg 范围内呈良好的线性关系(R=0.999 9)。

2.1.5 精密度试验 取0.232 mg/mL的对照品溶液，重复进样6次，每次10 μL，测定峰面积，计算RSD为3.27%，说明本法精密度良好。

2.1.6 重复性试验 分别取对叶百部样品6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件测定，计算 RSD 为 2.64%，说明本法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取一份供试品溶液，分别在0、2、4、12小时后进样测定，计算各峰面积RSD为4.21%，说明供试品溶液中对叶百部碱至少在12小时内是稳定的。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取已知含量(14.92 mg/g)的对叶百部样品6份，每份约0.25 g，按其含量的50%、100%和150%三个水平分别加入对叶百部碱对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件测定，计算平均回收率为103.9%，RSD为4.77%，说明该方法回收率较好。

2.2 对叶百部碱纯化工艺研究

2.2.1 对叶百部流浸膏的制备 取对叶百部药材200 g，用70%乙醇加热回流提取3次，每次1 h，合并提取液，旋至基本无醇，得到流浸膏，加入流浸膏2倍体积的1%盐酸溶液得到混悬液，离心得上清液。

2.2.2 影响对叶百部碱纯化因素的考察

(1)碱化程度的考察。分别取等量上清液3份，用浓氨水调pH至7～8、9～10和11～12，分别用等量的乙酸乙酯萃取3次，旋干乙酸乙酯萃取部分，用色谱甲醇溶出，定容于50 mL容量瓶中。按“2.1.1”项下方法测定对叶百部碱含量，结果见表1。

表1 不同碱化程度下对叶百部碱的含量

注：溶液总量为50 mL。下同。

由表1结果可知当碱化程度为7～8时对叶百部碱的含量最高，当pH升高到11～12时，TS的量明显变少，可能碱性过强对叶百部碱不稳定，因此在碱化时应将pH的值调到7～8。

(2)萃取溶剂的考察。分别取等量上清液3份，用浓氨水调至pH 8，分别用氯仿、乙酸乙酯、乙酸乙酯-石油醚(1∶1)等量萃取3次，HPLC测定含量，结果见表2。

表2 不同萃取溶剂下对叶百部碱的含量

由表2结果可知，当萃取溶剂为乙酸乙酯：石油醚(1∶1)时，对叶百部碱的含量最高，因此选择石油醚-乙酸乙酯(1∶1)为最佳萃取条件。

(3)有机溶剂萃取次数考察。取上清液1份，碱化后用石油醚-乙酸乙酯(1∶1)等量萃取，充分振摇，萃取4次，测量每次萃取溶液中对叶百部碱的含量，结果见表3。

表3 不同萃取次数下对叶百部碱的含量结果

由表3结果可知，对叶百部碱在第1次萃取中基本能萃取完全，从节约溶剂和时间的角度考虑，选择萃取1次即可。

(4)结晶溶剂的考察。取对叶百部药材按前述优化的方法处理后得到干浸膏，分别取3份等量浸膏，在甲醇、乙醇、甲醇-二氯甲烷中结晶，只有甲醇中析出对叶百部碱结晶，纯度98.9%，因此选择结晶溶剂为甲醇。

(5)纯化工艺验证。分别取对叶百部药材3份，每份50 g，分别用70%乙醇加热回流提取3次，每次1 h，旋至无醇味，得到流浸膏，加入流浸膏2倍体积的1%盐酸溶液得到混悬液，离心得上清液。上清液用浓氨水调至pH8，用乙酸乙酯-石油醚(1∶1)萃取1次，得到有机层部分，旋干，即得总碱浸膏。总碱浸膏在甲醇中结晶，得到对叶百部碱单体，分别测定对叶百部碱的纯度。总碱浸膏得率的RSD为4.42%，结晶析出量的RSD为4.43%，对叶百部碱的平均得率为药材的0.352%，结果见表4。

表4 纯化工艺验证结果

3 讨 论

本文通过对影响对叶百部碱纯化的关键因素的研究，建立了一种快速分离纯化对叶百部碱单体的方法。本课题组前期对同批次药材通过总碱硅胶柱层析得到对叶百部碱，得率约为0.1%，优化后工艺的得率为0.352%，得率有较大提高且方法更加简便。传统提取对叶百部碱一般碱化到pH10，然而对叶百部中的生物碱一般碱性都较小，本实验表明碱化到pH 8生物碱已经可以游离出来；传统萃取时一般用乙酸乙酯或氯仿萃取3次，但氯仿毒性较大，本实验表明用乙酸乙酯-石油醚(1∶1)萃取1次就可基本将对叶百部碱全部萃取出来。百部生物碱类一般极性较小，在甲醇中的溶解度随着温度和溶剂量的增加有较大增加，适合作为结晶溶剂。对叶百部中的生物碱结构都较相似，故本文提供的方法对百部中其他生物碱的提纯也具有一定的借鉴意义。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：132-133.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典：上[M].上海：上海科学技术出版社，1986，858.

[3] GREGER H.Structural relationships，distribution and biological activities of Stemona alkaloids[J].Planta Med，2006，72：99-113.

[4] SHINOZAKI H，ISHIDA M.Inhibitory actions of tuberostemonine on the excitatory transmission at the crayfish neuromuscular junction[J].Brain Research，1985，334：33-40.

[5] TERADA M，SANO M，ISHII A I，et al.Studies on chemotherapy of parasitic helminths(III).Effects of tuberostemonine from Stemona japonica on the motility of parasitic helminths and isolated host tissues[J].Nippon Yakurigaku Zasshi，1982：79：93-103.

[6] ZHOU X，LEUNG P H H，LI N，et al.Oral absorption and antitussive activity of tuberostemonine alkaloids from the roots of Stemona tuberosa.[J].Planta Med，2009，75：575-580.

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Study on Tuberostemonine Purification by Optimizing the Main Influencing Factors

He Yanhui，Zhang Lin，Zhang Chaofeng，Xu Xianghong，Zhang Mian*

Objective：To obtain a quick and efficient way to get tuberostemonine by optimizing key factors in this process.Methods：An HPLC-ELSD method was employed to determine the tuberostemonine content inStemonatuberosaextract.The contents of tuberostemonine were compared under different pH values，extract solvent，extract times and crystalline solvent.Results：The optimal purification conditions were as follows：the acidified ethanol extract was alkalized with ammonia to pH 8，and partitioned with ethyl acetate-petroleum ether(1∶1)for one time to obtain the total alkaloid extract(TAE).The columnar crystals of tuberostemonine could be directly obtained after dissolve the TAE in methanol with the purity more than 98%.Conclusion：A rapid and efficient purification method of tuberostemonine was obtained.

Stemonatuberosa;tuberostemonine;process optimization

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.02.005

2016-08-12

国家自然科学基金资助项目(30772702)。

贺艳慧(1990—)，女，在读硕士研究生，研究方向：中药活性成分和质量标准研究。E-mail：15298376084@163.com

*通讯作者：张勉，女，教授，博士生导师，研究方向：生药活性成分和质量标准研究。

R284.2

A

1006-9690(2017)02-0017-03