妊娠早期稽留流产患者绒毛组织中HIF-1α、BNIP3、LC3的表达*

袁恩武，王银芳，邢金芳，闫广伟，孙利环，代延朋

1)郑州大学第三附属医院检验科 郑州 450052 2)郑州大学第三附属医院围产保健科 郑州 450052

妊娠早期稽留流产患者绒毛组织中HIF-1α、BNIP3、LC3的表达*

袁恩武1)△，王银芳1)，邢金芳1)，闫广伟1)，孙利环2)，代延朋1)

1)郑州大学第三附属医院检验科 郑州 450052 2)郑州大学第三附属医院围产保健科 郑州 450052

△男，1967年12月生，硕士，主任技师，教授，研究方向：临床生物化学与分子生物学，E-mail：yuanenwu@126.com

稽留流产；绒毛组织；自噬；HIF-1α；BNIP3；LC3

目的：检测妊娠早期稽留流产患者绒毛组织中HIF-1α、BNIP3、LC3的表达，探讨滋养层细胞自噬异常与稽留流产的关系。方法：收集正常早孕妇女及稽留流产妇女绒毛组织各30例，采用实时荧光定量PCR法检测HIF-1α、BNIP3 mRNA的表达；采用免疫组化SP法及蛋白印迹法检测HIF-1α、BNIP3及LC3蛋白的表达。结果：两组绒毛组织中均可见HIF-1α、BNIP3及LC3蛋白的表达，HIF-1α主要定位于滋养细胞胞核及胞质，BNIP3及LC3主要定位于滋养层细胞胞质中。与正常早孕组相比，稽留流产组HIF-1α与BNIP3 mRNA和蛋白表达水平以及LC3Ⅱ/Ⅰ均明显下降(P<0.05)。结论：绒毛组织滋养层细胞中HIF-1α/BNIP3信号通路调节的低氧诱导自噬水平下降可能是稽留流产发生的重要机制。

稽留流产又称过期流产，指宫内胚胎或胎儿死亡之后未能及时自然排出[1]，是流产的一种特殊形式。目前稽留流产在我国的发生率高达13.4%[2]，随着国家二孩生育政策的放开,高龄孕妇的增加,其发病率有逐年增加的趋势，给社会和家庭带来沉重负担。妊娠期间，母胎界面是母体与胎儿进行物质交换的重要器官，而界面上的绒毛滋养层细胞是承担其功能并维持屏障作用的主要细胞，其功能障碍与妊娠结局密切相关。在妊娠早期滋养层细胞处于相对缺氧的环境中，缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达增加。研究[3]显示已知或未知病因可显著降低孕早期滋养层细胞HIF-1α的表达，使其不能耐受低氧环境，导致稽留流产的发生，但具体机制仍不明确。缺氧环境可以诱导自噬的发生，HIF-1α/BNIP3和AMPK/mTOR是低氧诱导自噬的两条信号通路[4]，并且HIF-1α/BNIP3是主要通路[5]。自噬是细胞利用溶酶体降解蛋白质、大分子物质及其他细胞成分的过程，是一种高度保守的细胞降解过程，在所有真核生物细胞中普遍存在，当缺氧、营养不足及损伤时作为一种应激反应出现。通常用LC3Ⅱ/Ⅰ来表示自噬水平[6]，比值降低表示自噬活性减弱，反之表示自噬活性增强。自噬在防治肿瘤[7]、神经退行性疾病[8]、心血管疾病[9]、糖尿病[10]、器官移植[11]等方面有积极作用。该研究以稽留流产孕妇绒毛组织为研究对象，对HIF-1α/BNIP3信号通路的关键蛋白进行检测，初步探讨自噬在稽留流产中的作用，进一步为稽留流产的防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年10月至2016年4月在郑州大学第三附属医院产科经B超及β-hCG动态监测结合临床证实为稽留流产的患者30例，年龄20～45(20.0±3.5)岁，孕龄49～63(58.7±8.6) d；选取同期经B超证实为活胎、因非意愿妊娠行人工流产术的正常早孕妇女30例，年龄20～45(30.1±5.2)岁，孕龄49～63(62.9±12.6) d。两组孕妇均为单胎，既往均无高血压、糖尿病及甲状腺功能亢进等其他全身性疾病病史，无吸烟、长期服用药物史，抗核抗体、抗心磷脂抗体、抗精子抗体、抗内膜抗体、抗卵巢抗体检查无异常，风疹病毒IgM、巨细胞病毒IgM、单纯疱疹病毒IgM、弓形虫IgM、生殖道支原体、衣原体检查无异常，生殖器解剖结构无异常，绒毛染色体检查无异常，孕期无急、慢性感染性疾病。该研究均获所有研究对象知情同意，且已经过该院伦理委员会的批准。

1.2 标本采集 于人工流产术后3 min内，快速收集患者绒毛组织并用无菌生理盐水冲洗干净。将绒毛分为3份，1份置于体积分数10%甲醛溶液中，固定24 h后行脱水、石蜡包埋及切片；另2份置于高压灭菌冻存管，并迅速放入液氮罐中，过夜后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 实时荧光定量PCR法检测绒毛组织中HIF-1α、BNIP3 mRNA的表达 取冻存绒毛组织约50 mg，于研钵中加入液氮研磨成粉末，采用Trizol法提取总RNA，检测总RNA的完整性、浓度及纯度。根据反转录试剂盒(日本Toyobo公司产品)说明书进行反转录，反应体系：上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，荧光染料SYBR Green 10.0 μL，加灭菌蒸馏水6.4 μL至总体积20 μL。以无RNA酶的水代替cDNA模板作阴性对照，样品及阴性对照均设3个复孔。每管混匀离心后置于实时荧光定量PCR仪中，PCR反应条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性15 s；60 ℃退火延伸1 min，共40个循环。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成(表1)。记录扩增曲线和熔解曲线，以测定样品扩增的特异性。根据PCR扩增曲线，得到每个样本的循环阈值(Ct)，采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

表1 引物序列及其扩增片段大小

1.4 免疫组化SP法检测绒毛组织中HIF-1α、BNIP3、LC3蛋白的表达 取绒毛组织切片，实验步骤按SP 法试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司产品)说明书进行。兔抗人HIF-1α、BNIP3单克隆抗体(英国Abcam公司产品)及兔抗人LC3单克隆抗体(美国CST公司产品)均稀释100倍使用。用PBS代替一抗作为阴性对照。最后DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱色，中性树胶封片，于高倍镜下观察染色情况。以细胞胞核和(或)胞质中出现棕黄色染色颗粒为阳性表达细胞。

1.5 蛋白印迹法检测绒毛组织中HIF-1α、BNIP3及LC3蛋白的表达 组织蛋白的提取：取约100 mg绒毛组织，在加入液氮的研钵中研磨成粉末后移入匀浆器中，并加入1 mL组织裂解液及10 μL苯甲基磺酰氟(PMSF),置于冰上裂解30 min后进行超声破碎，4 ℃ 14 000 r/min离心5 min，取上清，检测蛋白浓度，进行蛋白变性后置于-20 ℃保存待用。检测HIF-1α、BNIP3及LC3蛋白：分别配制80、150 g/L分离胶及40 g/L凝缩胶，待胶凝固后行SDS-PAGE电泳，蛋白上样量均为50 mg,电泳结束后将蛋白转移到硝酸纤维素膜(美国PALL公司产品)上，用50 g/L脱脂奶粉37 ℃封闭1 h后分别加入HIF-1α、BNIP3单克隆抗体(稀释度为1:500，美国Abcam公司产品)、兔抗人LC3单克隆抗体(稀释度为1:400，美国CST公司产品)、鼠抗人β-actin单克隆抗体(稀释度为1:5 000，英国Abcam公司产品)，4 ℃孵育过夜，洗膜后分别加入羊抗兔IgG二抗及羊抗鼠IgG二抗(稀释度为1:4 000，北京中杉金桥生物技术有限公司产品)，37 ℃孵育1 h后洗膜，使用Odyssey Clx红外荧光扫描成像系统对目的条带的灰度值进行分析，用目的条带与β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平，计算LC3Ⅱ与LC3 Ⅰ蛋白相对表达水平的比值(LC3Ⅱ/Ⅰ)。

1.6 统计学处理 应用SPSS 19.0进行分析，两组绒毛组织中HIF-1α、BNIP3 mRNA和蛋白表达，以及LC3Ⅱ/Ⅰ的比较采用两独立样本t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组绒毛组织中HIF-1α、BNIP3 mRNA的表达水平 见表2。稽留流产组绒毛组织中BNIP3 mRNA表达水平低于正常早孕组。

表2 2组绒毛组织中HIF-1α、BNIP3 mRNA的表达

2.2 两组绒毛组织中HIF-1α、BNIP3、LC3蛋白表达 免疫组化SP检测结果(图1)显示， 两组绒毛组织合体滋养层细胞与细胞滋养层细胞中均可见HIF-1α、BNIP3及LC3的阳性表达，HIF-1α蛋白主要定位于滋养层细胞胞核及胞质中，BNIP3及LC3蛋白主要定位于滋养层细胞胞质中。 蛋白印迹法检测结果见图2、表3。

A:正常早孕组;B:稽留流产组;1:HIF-1α蛋白；2：BNIP3蛋白；3：LC3蛋白。图1 两组绒毛组织中HIF-1α、BNIP3、LC3蛋白的表达(SP，×400)

1:正常早孕组；2:稽留流产组。图2 两组绒毛组织中HIF-1α、BNIP3、LC3蛋白的表达

表3 两组绒毛组织中HIF-1α、BNIP3蛋白表达和LC3Ⅱ/Ⅰ的比较

3 讨论

在妊娠早期,母胎循环建立之前，滋养层细胞处于相对缺氧的环境中，缺氧对滋养层细胞的增殖、分化及侵袭具有重要的调节作用。有研究[12]显示，在早期妊娠中胎盘氧浓度仅2%，作为氧平衡的重要调节因子，HIF-1α的表达在正常妊娠过程中于孕7～9周时达到高峰，之后便开始下降[13]，HIF-1α的高表达可使胚胎耐受低氧环境，促进滋养层细胞发育，对于调节胎盘形态、血管生成及滋养层细胞结局具有重要作用[14]。该研究选取妊娠早期的绒毛组织进行研究，结果发现HIF-1α主要表达于绒毛滋养层细胞胞核与胞质中，同时稽留流产组绒毛组织中HIF-1α蛋白的表达水平显著低于正常早孕组，与以往研究[15]结果一致。有研究[16]发现，3%氧浓度下JEG细胞的侵袭及迁移能力相较于常氧条件下显著增强；Koklanaris等[17]发现，与对照组相比，在低氧条件下，HTR-8 /SVneo细胞迁移相关基因表达明显升高；孕早期低氧环境可诱导血管内皮生长因子表达，促进胎盘中血管的生成。以上研究提示，低氧对于滋养层细胞的侵袭、迁移及血管生成起着积极的促进作用，这对于妊娠早期正常妊娠的维持起重要作用。在妊娠早期，HIF-1α蛋白表达下降，可能通过影响滋养层细胞的侵袭、迁移及血管生成，参与胎盘功能障碍及稽留流产的发生发展。

BNIP3表达受HIF-1α依赖的缺氧的调节，属于促凋亡蛋白，主要定位于线粒体外膜。近年来，BNIP3在自噬、肿瘤进展及化疗耐药方面的研究越发受到关注。Burton等[18]发现沉默BNIP3后导致依赖BNIP3的细胞自噬降低；Bellot等[19]也证实依赖HIF-1α诱导的BNIP3高表达是低氧诱导自噬的关键；Liang等[20]发现BNIP3可通过将Beclin-1从Beclin-1/Bcl-2复合体解离释放，从而激活自噬。该研究结果显示，稽留流产绒毛组织中BNIP3蛋白的表达下降，提示BNIP3在低氧诱导自噬途径中具有重要作用。BNIP3作为促凋亡蛋白，可促进细胞凋亡，也可通过自噬，维持内环境稳态，促进细胞存活[21]，其含量的变化可影响滋养层细胞的生存结局，进而导致不良妊娠的发生。

LC3是自噬的重要标志物，存在于自噬体的膜上，当自噬形成时，LC3Ⅰ转变为LC3Ⅱ,因此LC3Ⅱ/Ⅰ可以表示自噬水平的高低[6]。有研究[22]表明，在胎盘组织中自噬作为应对环境压力的重要途径，可通过抑制凋亡促进细胞存活，可通过促进细胞存活维持滋养细胞完整性，保护胎儿免受病毒感染；同时研究[23]发现具有自噬缺陷的滋养层细胞侵袭能力明显减弱，且血管重建受到抑制，导致血管生成不足，加重其缺氧应激状态。该研究显示稽留流产组绒毛组织中LC3Ⅱ/Ⅰ较正常早孕组降低，表明其自噬水平下调，提示在低氧环境中，稽留流产绒毛滋养层细胞自噬减弱，使其不足以应对低氧环境带来的一系列压力，从而发生稽留流产。

综上所述，低氧可以通过HIF-1α/BNIP3信号通路诱导滋养层细胞发生自噬，且低氧诱导滋养层细胞自噬水平下降可能参与了稽留流产的发生发展。作者的研究结果为进一步探索稽留流产的机制和寻求有效防治提供了新的思路。

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(2016-09-26收稿 责任编辑李沛寰)

Expressions of HIF-1α,BNIP3,LC3 in villi from with women early pregnancy missed abortion

YUANEnwu1),WANGYinfang1),XINGJinfang1),YANGuangwei1),SUNLihuan2),DAIYanpeng1)

1)DepartmentofClinicalLaboratory,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofPerinatalHealth,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

missed abortion；villous tissue；autophagy；HIF-1α；BNIP3；LC3

Aim: To investigate the expressions of HIF-1α,BNIP3,LC3 in villous tissue from with women early pregnancy missed abortion and the relationship between the abnormal autophagy in trophoblast cells and missed abortion. Methods: Villous tissue from healthy women with normal pregnancy(n=30) and women with missed abortion(n=30) were collected. RT-PCR was utilized to measure the expression levels of HIF-1α,BNIP3 mRNA; immunohistochemical SP method and Western blot were performed to determine the position and expression levels of HIF-1α,BNIP3 and LC3 Ⅱ/Ⅰprotein in villous tissue.Results: HIF-1α,BNIP3 and LC3 could be found in villous tissue from the two groups by immunochemical staining; HIF-1α was mainly localized in the nucleus and cytoplasm of trophoblast cells, BNIP3 and LC3 were mainly located in the cytoplasm of trophoblast cells. The mRNA expression of BNIP3 and protein expression levels of HIF-1α,BNIP3 and LC3Ⅱ/Ⅰ were significantly lower in villous tissue from missed abortion group than those from the normal control group(P<0.05). Conclusion: Autophagy mediated by HIF-1α/BNIP3 signaling pathway in the villous trophoblast cells may be the important mechanism of the occurrence of missed abortion.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.023

*河南省科技厅创新团队项目 20140269

R714.2