萝卜硫素对结直肠癌SW620细胞增殖、凋亡及迁移的影响*

罗真真，张 震，乔亚敏，陈新峰，黄 岚，张 毅

1)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院生物治疗中心 郑州 450052 3)河南省肿瘤免疫治疗工程技术研究中心 郑州 450052 4)郑州大学生命科学学院 郑州 450001

萝卜硫素对结直肠癌SW620细胞增殖、凋亡及迁移的影响*

罗真真1,2,3)，张 震1,2,3)，乔亚敏1,2,3)，陈新峰1,2,3)，黄 岚1,2,3)，张 毅1,2,3,4)#

1)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院生物治疗中心 郑州 450052 3)河南省肿瘤免疫治疗工程技术研究中心 郑州 450052 4)郑州大学生命科学学院 郑州 450001

#通信作者，男，1964年4月生，博士，教授，主任医师，研究方向：肿瘤免疫学、肿瘤干细胞和生物细胞治疗，E-mail：yizhang@zzu.edu.cn

萝卜硫素;结直肠癌;SW620细胞；STAT3;NF-κB;MMP

目的：观察萝卜硫素(SFN)对结直肠癌SW620细胞增殖、凋亡及迁移的影响，并探讨其可能的作用机制。方法：采用CCK-8法检测0、5、10、15、20 μmol/L SFN处理48、72 h对SW620细胞增殖能力的影响，采用流式细胞术检测0、5、10、15、20 μmol/L SFN处理24、48 h对SW620细胞凋亡的影响，采用细胞划痕实验观察20 μmol/L SFN处理24 h对SW620细胞迁移的影响，并采用Western blot法检测细胞中STAT3、NF-κB、p-STAT3、p-NF-κB及MMP-2、MMP-9蛋白的表达。结果：随着SFN浓度的升高，SW620细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率升高(P<0.05)。同时20 μmol/L SFN可明显减弱SW620细胞的迁移能力，降低p-STAT3、p-NF-κB与MMP-2及MMP-9蛋白的表达(P<0.05)。结论：SFN抑制SW620细胞增殖、促进其凋亡的机制可能与降低p-STAT3、p-NF-κB的表达有关，抑制侵袭及转移的机制可能与其降低MMP-2及MMP-9蛋白的表达有关。

结直肠癌是最常见的胃肠道肿瘤，其5 a生存率较低，发现时大多已处于晚期，且复发率较高[1]。目前常用的化疗药物如5-FU和丝裂霉素等临床疗效尚不能令人满意，且伴有很强的毒副作用，严重影响患者生活质量[2]。因此，开发疗效确切且毒副作用较小的新药迫在眉睫。植物类抗肿瘤药物如姜黄素、萝卜硫素(sulfraphane，SFN)等，以其抗肿瘤效果明确、毒副反应少、可增强机体的抗病能力以及减少术后复发、转移等优点逐渐引起人们的关注[3-4]。SFN亦称莱菔硫烷，提取自西兰花、芥蓝、北方圆红萝卜等十字花科植物。有研究[5]表明，SFN具有很强的抗癌防癌作用，它在体外能够抑制肿瘤细胞的增殖，引起肿瘤细胞的凋亡和细胞阻滞，诱导人体内的Ⅱ相代谢酶，同时抑制Ⅰ相代谢酶的产生，最终通过多种酶体系排出致癌物和自由基等有害成分。然而,SFN抗癌作用机制目前尚未完全了解。作者通过体外培养结直肠癌SW620细胞株，观察SFN对SW620细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SW620细胞购于中国科学院细胞所；胎牛血清、DMEM高糖培养基购于Gibco公司；SFN、胰蛋白酶、膜连蛋白-异硫氢酸荧光素(Annexin V-FITC)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)购自美国Sigma公司；STAT3、p-STAT3、NF-κB、p-NF-κB、MMP-2、MMP-9、β-actin抗体购于CST公司。

1.2 细胞培养 SW620细胞采用含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM高糖培养基，于37 ℃、体积分数5% CO2的细胞培养箱培养，每隔2 d传代1次，选取状态良好的对数生长期细胞进行实验。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖 取对数生长期的SW620细胞，以5×104mL-1的密度接种至96孔板，每孔100 μL。贴壁后分别加0、5、10、15、20 μmol/L 的SFN，每个药物浓度组设5个复孔。分别培养48及72 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，避光孵育2 h，用酶联免疫检测仪在波长450 nm处测定光密度值，取均值，表示细胞增殖能力。实验重复3次。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期的SW620细胞，以4.0×105mL-1密度接种于12孔板,每孔1 mL。贴壁后分别加入浓度为0、5、10、15、20 μmol/L的SFN，分别培养24及48 h后，胰蛋白酶消化细胞，1 500 r/min离心，弃上清。 PBS重悬细胞，离心洗涤2次，加入200 μL Binding Buffer和1 μL Annexin V-FITC，室温避光孵育15 min。上机前再加入PI染液2 μL，立即上机检测，计算细胞凋亡率。实验重复5次。

1.5 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 取对数生长期的SW620细胞，以5×105个/孔接种于6孔板，加入2 mL培养基，培养24 h后细胞长满单层，用10 μL枪头在中间划一横线，分2组，分别加入20 μmol/L SFN和同等体积DMSO(对照组)，0、24 h后分别观察照相，使用图像处理软件测量划痕宽度。划痕愈合度=(0 h 划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。实验重复5次。

1.6 Western blot法检测凋亡及侵袭相关蛋白的表达 取对数生长期的SW620细胞，调整细胞密度至4.0×105mL-1，接种于6孔板，总体积2 mL。待细胞贴壁后，分2组，分别加入20 μmol/L SFN和同等体积DMSO(对照组)。培养24 h后，收集悬浮及贴壁的细胞，加入细胞裂解液，提取蛋白，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液。使用BCA法检测蛋白浓度，加入4×Loading Buffer蛋白上样缓冲液，煮沸 10 min后上样，每孔上样量保证为30 μg。使用含体积分数5% BSA的TBS将一抗(STAT3、p-STAT3、NF-κB、p-NF-κB、MMP-2、MMP-9、β-actin)稀释至合适浓度，4 ℃过夜，二抗封闭孵育1 h，TBST 清洗3次，每次 5 min,ECL发光液孵育后，应用凝胶成像系统拍照，以目的蛋白与β-actin灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.7 统计学处理 采用SPSS 21.0处理数据。采用单因素方差分析以及LSD-t检验比较不同浓度的SFN处理不同时间细胞增殖能力、凋亡率的差异，采用两独立样本t检验比较对照组和20 μmol/L SFN处理组划痕愈合度以及STAT3、p-STAT3、NF-κB、p-NF-κB、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同浓度SFN对SW620细胞增殖能力的影响 结果见表1。由表1可知，作用48和72 h，随SFN浓度的增加，SW620细胞增殖能力均呈降低的趋势。

表1 SFN对SW620细胞增殖能力的影响

*：与0 μmol/L组相比，P<0.05;#：与5 μmol/L组相比，P<0.05;△:与10 μmol/L组相比，P<0.05。

2.2 不同浓度SFN对SW620细胞凋亡的影响

结果见表2。由表2可知，作用24 h和48 h，随SFN浓度的增加，SW620细胞凋亡率呈升高的趋势。

表2 SFN对SW620细胞凋亡率的影响 %

*：与0 μmol/L组相比，P<0.05；#：与5 μmol/L组相比，P<0.05；△：与10 μmol/L组相比，P<0.05;☆:与15 μmol/L组相比，P<0.05。

2.3 SFN对SW620细胞迁移能力的影响 20 μmol/L SFN处理组划痕愈合度为(32.681±4.620)%，较对照组[(67.271±5.531)%]明显降低(t=10.734,P<0.001)。

2.4 SFN对SW620细胞凋亡及侵袭相关蛋白表达的影响 20 μmol/L SFN处理细胞24 h后，SW620细胞STAT3、NF-κB的表达与对照组相比差异无统计学意义，p-STAT3、p-NF-κB、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平较对照组下降。结果见图1及表3。

1：对照组；2：20 μmol/L SFN处理组。图1 SFN对SW620细胞凋亡及侵袭相关蛋白表达水平的影响

表3 2组细胞中STAT3、p-STAT3、NF-κB、p-NF-κB、MMP-2与MMP-9蛋白的表达

3 讨论

Hanahan等[6]总结和提出了肿瘤十大特征，包括细胞无限增殖，抑制细胞死亡，诱导血管生成以及激活侵袭和转移，炎症促进肿瘤等。与其他人源性肿瘤的研究结果[7-8]相似，该实验结果表明SFN可有效促进结直肠癌SW620细胞凋亡，抑制其增殖及迁移能力。

此外，该研究结果还显示SFN可显著降低结直肠癌细胞中STAT3和NF-κB的磷酸化水平，抑制STAT3及NF-κB信号通路。研究[9-10]发现，STAT3具有信号转导和转录激活双重作用，通过介导炎症因子的过表达并抑制肿瘤特异性免疫应答，诱导肿瘤发生发展。而NF-κB是一种转录因子，参与机体免疫应答、炎症反应，并调控多种功能基因的表达。此外，异常活化的NF-κB既可导致细胞周期调节失控，还可通过上调促细胞存活基因和抗凋亡基因表达，从而保护细胞免于凋亡，同时也与肿瘤细胞迁移、扩散与转移密切相关[11-12]。SFN可能通过降低STAT3、NF-κB的磷酸化水平，从而促进SW620细胞凋亡，抑制其增殖。

临床观察表明，癌细胞转移是大多数恶性肿瘤患者死亡的主要原因之一，因此，癌细胞浸润与转移是抗肿瘤机制研究的重点，也是许多研究关注的热点。肿瘤侵袭转移是一个多步骤的过程，原发部位肿瘤需穿透基底膜才能侵入血管或淋巴管。MMPs可特异性降解基底膜中的有效成分及细胞外基质，从而破坏基底膜，为癌细胞浸润与转移排除了首要障碍；还可通过促进毛细血管新生等促进肿瘤细胞的生长及扩散[13]。MMP-2及MMP-9作为MMP家族成员，有报道[14]显示其表达异常与结直肠恶性肿瘤的浸润和转移关系密切。该实验中，20 μmol/L SFN处理后，SW620细胞的迁移能力减弱，同时MMP-2及MMP-9蛋白的表达水平降低，推测SFN抑制SW620细胞侵袭迁移能力的机制可能与降低MMP-2及MMP-9蛋白的表达有关。

综上所述，SFN在体外可抑制结直肠癌细胞SW620增殖、促进其凋亡，同时可减弱SW620细胞的迁移能力，推测SFN降低p-STAT3、p-NF-κB与MMP-2、MMP-9蛋白的表达可能是其发挥抗肿瘤作用的机制之一，为SFN在结直肠癌治疗的临床应用提供了实验基础。

[1]TORRE LA,SIEGEL RL,WARD EM,et al.Global cancer incidence and mortality rates and trends:an update[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2016,25(1):16

[2]杨晓利,王峰, 夏金,等.替吉奥或卡培他滨联合奥沙利铂一线治疗晚期结直肠癌效果对比分析[J].郑州大学学报(医学版),2013,48(5):687

[3]KUPPUSAMY P,YUSOFF MM,MANIAM GP,et al.Nutraceuticals as potential therapeutic agents for colon cancer:a review[J].Acta Pharm Sin B,2014,4(3):173

[4]单延红,张海军,徐志刚,等.姜黄素联合人类细胞因子诱导的杀伤细胞对卵巢癌细胞增殖的抑制作用及其机制[J].吉林大学学报(医学版),2011,37(2):220

[5]HOUGHTON CA,FASSETT RG,COOMBES JS.Sulforaphane:translational research from laboratory bench to clinic[J].Nutr Rev,2013,71(11):709

[6]HANAHAN D,WEINBERG RA.Hallmarks of cancer:the next generation[J].Cell,2011,144(5):646

[7]朱海鹏.萝卜硫素对 LNCaP 细胞增殖、周期、凋亡及 IGFBP-3、NF-κB表达的影响[J]. 郑州大学学报(医学版), 2014, 49(6): 801

[8]TUORKEY MJ.Cancer therapy with phytochemicals: present and future perspectives[J].Biomed Environ Sci,2015,28(11):808

[9]BROMBERG J,DARNELL JE Jr.The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function[J].Oncogene,2000,19(21):2468

[10]李春雨,赵海龙.核转录因子STAT3及其在结直肠癌中的应用价值[J].中国医科大学学报,2015,44(1):1

[11]SAKAMOTO K,MAEDA S,HIKIBA Y,et al.Constitutive NF-kappaB activation in colorectal carcinoma plays a key role in angiogenesis, promoting tumor growth[J].Clin Cancer Res,2009,15(7):2248

[12]HORST D,BUDCZIES J,BRABLETZ T,et al.Invasion associated up-regulation of nuclear factor kappaB target genes in colorectal cancer[J].Cancer,2009,115(21):4946

[13]KRARUP PM,ELD M,HEINEMEIER K,et al.Expression and inhibition of matrix metalloproteinase(MMP)-8,MMP-9 and MMP-12 in early colonic anastomotic repair[J].Int J Colorectal Dis,2013,28(8):1151

[14]KESSENBROCK K,PLAKS V,WERB Z.Matrix metalloproteinases:regulators of the tumor microenvironment[J].Cell,2010,141(1):52

(2016-08-08收稿 责任编辑徐春燕)

Effects of sulforaphane on proliferation,apoptosis and migration of SW620 cells

LUOZhenzhen1,2,3),ZHANGZhen1,2,3),QIAOYamin1,2,3),CHENXinfeng1,2,3),HUANGLan1,2,3),ZHANGYi1,2,3,4)

1)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Bio-therapyCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)EngineeringandTechnologyResearchCenterforTumorImmunotherapyofHenanProvince,Zhengzhou450052 4)SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

sulforaphane;colorectal cancer;SW620 cell;STAT3;NF-κB;MMP

Aim: To observe the effects of sulforaphane(SFN) on proliferation, apoptosis, and migration of SW620 cellsinvitroand to explore the potential mechanism involved.Methods: SW620 cells were treated with 0，5，10，15，20 μmol/L SFN for 48，72 h and the cell proliferation was detected by CCK-8 kit. SW620 cells were treated with 0，5，10，15，20 μmol/L SFN for 24，48 h and the cell apoptosis was detected by flow cytometry. SW620 cells were treated with 20 μmol/L SFN for 24 h, the migration capability was measured by the wound healing test, and the protein expression levels of STAT3, p-STAT3, NF-κB, p-NF-κB, MMP-2 and MMP-9 were determined by Western blot. Results: SFN significantly reduced the proliferation and increased apoptosis in a dose-dependent manner(P<0.05). The ability of migration was significantly inhibited by 20 μmol/L SFN(P<0.05),and the expressions of p-STAT3, p-NF-κB, MMP-2, and MMP-9 protein were significantly down-regulated(P<0.05). Conclusion: It is indicated that SFN could inhibit the proliferation and the ability of migration, and induce apoptosis of SW620 cells, which may be related with its down-regulating the expressions of p-STAT3, p-NF-κB, MMP-2 and MMP-9 protein.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.010

*河南省科技厅基础与前沿技术研究基金 112300410153，122300410155

R735.3