慢病毒介导的FOXQ1过表达对人脐带间充质干细胞衰老的影响*

张 涛，王 攀，马珊珊，石振庆，程 康，黄团结，刘艳霞，杨 波，关方霞#

1)郑州大学生命科学学院 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院检验科；河南省检验医学重点实验室 郑州 450052 3)郑州大学第一附属医院神经外科 郑州 450052

慢病毒介导的FOXQ1过表达对人脐带间充质干细胞衰老的影响*

张 涛1)，王 攀2)#，马珊珊1)，石振庆1)，程 康1)，黄团结1)，刘艳霞1)，杨 波3)，关方霞1)#

1)郑州大学生命科学学院 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院检验科；河南省检验医学重点实验室 郑州 450052 3)郑州大学第一附属医院神经外科 郑州 450052

#通信作者，关方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干细胞与再生医学，E-mail：guanfangxia@126.com；王攀，男，1986年11月生，博士，助理研究员，研究方向：细胞衰老机制，E-mail：wpzzu2004@126.com

FOXQ1；过表达；慢病毒载体；人脐带间充质干细胞；衰老

目的：构建FOXQ1慢病毒载体，探究FOXQ1过表达对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)衰老的影响。方法：PCR扩增FOXQ1序列，构建慢病毒pHBLV-FOXQ1-Puro重组载体，包装病毒、感染hUC-MSCs(过表达组)，感染空载体病毒的hUC-MSCs为对照，分别采用实时荧光定量PCR、Western blot检测2组细胞FOXQ1 mRNA及蛋白的表达水平，采用CCK-8法检测细胞增殖能力的变化，采用SA-β-Gal与AP染色检测hUC-MSCs衰老表型。结果：慢病毒pHBLV-FOXQ1-Puro重组载体构建成功，病毒包装后感染hUC-MSCs效果良好。过表达组FOXQ1蛋白及mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05)。过表达组细胞增殖能力较强，FOXQ1过表达可以延缓hUC-MSCs衰老。结论：成功建立FOXQ1稳定过表达的hUC-MSCs细胞系，FOXQ1过表达可以延缓hUC-MSCs衰老。

叉头框(forkhead box,FOX)家族在胚胎发育、糖类和脂类代谢、细胞周期调控、细胞衰老、免疫调节等多种生物学过程中发挥重要作用[1]。FOXQ1是近年研究较多的FOX家族成员，目前发现其在多种肿瘤组织高表达，通过促进上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[2]，增强癌细胞的增殖侵袭能力[3]。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)在体外培养过程中容易衰老，影响其进一步实验应用。作者旨在建立一种成熟有效的FOXQ1过表达手段，进一步探究过表达该基因在hUC-MSCs衰老中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 hUC-MSCs由脐带(正常剖宫产的健康产妇志愿捐献)分离、纯化后，培养至第3代使用。慢病毒包装质粒pHBLV-Puro、psPAX2、pMD2.G及FOXQ1模板质粒pIRES-FOXQ1均由北京大学基础医学院童坦君教授惠赠。293T细胞由郑州大学干细胞实验室保存。标准胎牛血清、DMEM/F12培养基、DMEM高糖培养基、磷酸盐缓冲液购自Hyclone公司。KOD FX DNA聚合酶购自Toyobo公司，核酸内切酶、DNA连接酶、反转录试剂盒及SYBR Premix Ex TaqⅡ酶购自TaKaRa公司。无内毒素质粒提取试剂盒购自TIANGEN公司，磷酸钙转染试剂盒购自Leagene公司，嘌呤霉素购自Gene Operation公司。全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RNA提取试剂盒及PCR相关引物购自上海生工生物工程有限公司，FOXQ1一抗购自美国Santa Cruz公司，GAPDH一抗及山羊抗兔二抗购自武汉三鹰公司。CCK-8购自日本同仁公司。SA-β-Gal检测试剂盒购自美国GENMED，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，AP)显色试剂盒购自碧云天公司。

1.2 pHBLV-FOXQ1-Puro慢病毒骨架质粒的构建 以pIRES-FOXQ1质粒为模板进行PCR。上游引物5’-CGGAATTCATGAAGTTGGAGGTGTTCG-3’，下游引物5’-GCTCTAGATCAGGCTAGGAGCGTCT-3’。反应体系参照KOD FX DNA聚合酶使用说明书。反应条件：94 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，34个循环，72 ℃ 10 min，电泳后成像观察切胶回收，将PCR产物插入pHBLV-Puro质粒EcoR Ⅰ、XbaⅠ酶切位点之间，调节目的片段及质粒片段的酶切产物质量浓度至50 mg/L，按5:1比例16 ℃连接，转化热激后，涂板倒置于37 ℃烘箱15 h。挑取若干单克隆摇菌16 h，菌液经PCR鉴定，阳性克隆提取质粒后送至上海生工生物工程有限公司测序。

1.3 细胞的培养 hUC-MSCs的分离、培养参照文献[4]。293T细胞使用DMEM高糖培养基，培养条件同hUC-MSCs。

1.4 慢病毒包装及感染 包装：将慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G、pHBLV-FOXQ1-Puro及pHBLV-Puro分别通过转化扩大，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒。将293T细胞接种至10 cm细胞培养皿中，12 h后将pHBLV-FOXQ1-Puro(A组)或pHBLV-Puro(B组)、psPAX2、pMD2.G按照1:1:1比例，磷酸钙法共转染293T细胞，8 h后换液，36 h后提取病毒液，1 500 r/min离心5 min后，取上清液通过0.45 μm滤头过滤，4 ℃保存备用(1周内使用)。24 h后可二次提取病毒液。

感染：感染前12 h将hUC-MSCs传代，使感染前细胞汇合度达到约40%。将A、B 2组病毒液分别感染hUC-MSCs(过表达组和对照组)，并加入终质量浓度为5 mg/L聚凝胺，感染8 h后，更换为正常培养基。第1次感染24 h后可进行二次感染。感染3 d后，加入终质量浓度1 mg/L嘌呤霉素筛选3～5 d。

1.5 Western blot检测FOXQ1蛋白的表达水平 收集2组hUC-MSCs，计数后取1×106个，提取细胞全蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离。加入按1:1 000稀释的FOXQ1与GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜，加入1:4 000稀释的相应二抗孵育2 h，使用ECL发光液曝光，图片使用Image J软件进行灰度分析。实验重复3次。

1.6 实时荧光定量PCR检测FOXQ1 mRNA的表达水平 收集2组hUC-MSCs，计数后取5×105个，提取细胞总RNA，反转录后于-20 ℃保存。使用SYBR Green染料法，反应条件：95 ℃变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，45个循环。用2-ΔΔCT法计算相对表达量。实验重复3次。引物序列及扩增产物大小见表1。

表1 引物序列及扩增产物大小

1.7 CCK-8法检测细胞增殖 分别取2组第10代hUC-MSCs，计数后接种于96孔板，每孔2×103个细胞，实验设置3个复孔。分别于12、36、60、84 h加入CCK-8孵育2 h，在酶标仪波长450 nm处检测光密度值。实验重复3次。

1.8 SA-β-Gal染色 分别取2组第5代hUC-MSCs，计数后以每孔2×105个细胞接种于6孔板，每组设3个复孔，8 h后，使用SA-β-Gal检测试剂盒检测细胞衰老，衰老细胞呈蓝色。于倒置显微镜下观察，取3个视野，计数衰老细胞。

1.9 AP染色 取2组第10代hUC-MSCs，计数后以每孔1×105个细胞接种于6孔板，每组设3个复孔，8 h后，加入40 g/L多聚甲醛溶液固定15 min，按照试剂盒说明书进行AP染色，阳性细胞染色偏向深棕色。倒置显微镜下观察染色结果，选取3个视野，计数阳性细胞。

1.10 统计学处理 使用SPSS 17.0处理数据。使用两独立样本t检验比较2组hUC-MSCs FOXQ1蛋白和mRNA表达水平及SA-β-Gal与AP染色阳性细胞数的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 pHBLV-FOXQ1-Puro载体构建结果 PCR扩增结果条带单一，亮度高，引物特异性强(图1)；重组质粒测序结果与FOXQ1基因CDS序列(NM_033260.3)进行BLAST比对，全长1 212 bp，完全一致，提示载体构建成功。

1：Marker;2:FOXQ1。图1 PCR基因扩增全长凝胶电泳图

2.2 hUC-MSCs分离培养及感染后形态学观察 原代干细胞呈扁平长梭状，体型较小，感染后第3代hUC-MSCs较原代细胞略长(图2)。

A：原代hUC-MSCs；B：对照组；C：过表达组。图2 hUC-MSCs形态学观察(×100)

2.3 2组hUC-MSCs中FOXQ1蛋白和mRNA的表达水平比较 过表达组hUC-MSCs中FOXQ1蛋白和mRNA的表达水平均高于对照组(图3、表2)。

图3 2组Western blot结果比较

表2 2组FOXQ1蛋白及mRNA表达水平的比较

2.4 细胞增殖检测结果 过表达组细胞生长速度高于对照组(图4)。

A：过表达组；B：对照组。图4 2组增殖曲线

2.5 SA-β-Gal和AP染色结果 过表达组hUC-MSCs蓝染细胞(衰老细胞)数明显低于对照组，AP染色阳性细胞数明显多于对照组，见图5、6，表3。

A：过表达组；B：对照组。图5 2组hUC-MSCs SA-β-Gal染色观察(×100)

A：过表达组；B：对照组。图6 2组hUC-MSCs AP染色观察(×100)

表3 2组SA-β-Gal与AP染色结果比较阳性细胞数

3 讨论

FOXQ1蛋白作为FOX家族重要的一员，具有重要的生物学作用。FOXQ1在结肠癌[5]、乳腺癌[6]、食管癌[7]、肝癌[8]等多种癌组织异常高表达，FOXQ1的表达量直接与癌变阶段、恶性程度正相关[9]。而且，高表达FOXQ1的患者多预后不佳[10]。FOXQ1在细胞增殖、侵袭及细胞周期分布等方面具有重要调控作用。在乳腺癌细胞株MDA-MB-231及胃癌细胞株 MGC-803 中沉默FOXQ1可以显著降低癌细胞增殖能力[11-12]。肿瘤细胞的侵袭与转移在肿瘤发生发展中具有重要意义[13-14]，而FOXQ1可直接被一些microRNA调控[15]，进而增强肿瘤细胞侵袭转移能力。

相对于真核质粒转染外源基因表达不稳定等缺点，慢病毒系统具有对外源基因容量大、导入稳定性强、感染细胞种类丰富等优势，近年来获得了广泛使用。同时，随着技术进步，慢病毒包装系统已经发展到第4代，具有更强的选择性、稳定性和安全性[16]。因此，通过慢病毒包装系统过表达FOXQ1是一种安全稳定且成熟有效的手段。

该研究首先构建了FOXQ1过表达慢病毒，感染hUC-MSCs，并初步探究了FOXQ1过表达对hUC-MSCs衰老的影响。有研究[17]表明，随着hUC-MSCs传代次数的增加，其体外增殖能力、分化能力均呈下降趋势。该研究结果显示，过表达组hUC-MSCs增殖能力明显强于对照组；衰老相关SA-β-Gal染色显示，过表达组细胞衰老程度弱于对照组，AP染色实验显示了相同的结果。上述结果表明FOXQ1过表达可有效延缓hUC-MSCs衰老，增强干细胞作用。

综上所述，实验建立了FOXQ1慢病毒稳定表达系统，在hUC-MSCs中成功过表达FOXQ1，并初步探讨了FOXQ1对hUC-MSCs的抗衰老作用，为后续研究FOXQ1过表达延缓hUC-MSCs衰老的机制奠定了基础。

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(2016-09-08收稿 责任编辑徐春燕)

Effects of lentivirus-mediated FOXQ1 overexpression on senescence of hUC-MSCs

ZHANGTao1),WANGPan2),MAShanshan1),SHIZhenqing1),CHENGKang1),HUANGTuanjie1),LIUYanxia1),YANGBo3),GUANFangxia1)

1)SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity;KeyClinicalLaboratoryofHenanProvince,Zhengzhou450052 3)DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

FOXQ1；overexpression；lentivirus vector；hUC-MSC；senescence

Aim: To construct the FOXQ1 overexpression lentivirus vector and explore the effect of FOXQ1 overexpression on human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) senescence. Methods: After amplification of FOXQ1 sequences, the recombinant lentivirus vector(pHBLV-FOXQ1-Puro) was constructed. The hUC-MSCs overexpressing FOXQ1 infected by the prepared vector and screened by puromycin screening. The hUC-MSCs infected by the empty vector were used as control. The protein and mRNA expression levels of FOXQ1 were measured by Western blot and qPCR. CCK-8 assay was used to test the ability of cell proliferation. SA-β-Gal and AP staining assay were used to detect the effect of FOXQ1 overexpression on cell senescence.Results: pHBLV-FOXQ1-Puro recombinant vector was constructed successfully, and its infection was effective. The protein and mRNA expression levels of FOXQ1 overexpression group were significantly higher than control group (P<0.05). CCK-8 results showed that FOXQ1 overexpression could enhance the ability of cell proliferation. SA-β-Gal and AP staining results showed that FOXQ1 overexpression could delay senescence of hUC-MSCs. Conclusion: The hUC-MSCs overexpressing FOXQ1 have been successfully constructed, and FOXQ1 overexpression could delay the senescence of hUC-MSCs.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.005

*国家自然科学基金资助项目 81471306，81501200；河南省高校科技创新团队基金资助项目 15IRTSTHN022；河南省科技创新人才计划项目 154200510008；中国博士后科学基金面上资助项目 2015M572122；国家教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目 20114101110004

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