急性肝衰竭大鼠模型中大黄提取物治疗作用分析

叶丹　王凤玲

[摘要] 目的 探讨对急性肝衰竭大鼠模型采用大黄提取物的治疗作用。 方法 利用D-氨基半乳糖建立大鼠急性肝功能衰竭模型。选取SD大鼠15只，随机分为3组（n=5）。A组为健康大鼠，不施加任何试验处理；B组为肝衰竭大鼠，造模后12 h尾静脉注射1 mL生理盐水；C组为大黄提取物治疗组，造模后12 h向腹腔注射大黄提取物（10 mL/kg），每日3次，连续注射2 d。各组大鼠均在造模48 h之后注射10%的水合氯醛进行麻醉，取门静脉血以及肝组织标本进行试验指标观测。 结果 B组大鼠造模后出现急性肝衰竭表现，而A组、C组均无或仅有少量症状出现。B组大鼠在造模48 h后血清ALT、AST以及TBiL含量均出现显著上升，而C组出现下降。 结论 大黄提取物有利于促进急性肝衰竭大鼠的恢复，并且能促进骨髓间充质干细胞的增殖，增强BMSCs细胞移植的治疗效果。此治疗方法能够促进肝细胞的再生和修复，为肝功能障碍患者提供一定的治疗。

[关键词] 大黄提取物；急性肝衰竭；大黄素

[中图分类号] R575.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）12-0032-03

[Abstract] Objective To explore the therapeutic effect of rhubarb extract in the model of rats with acute liver failure. Methods D-galactosamine was used to establish the model of rats with acute liver failure. A total of 15 SD rats were selected and randomly divided into 3 groups（n=5）. Group A was healthy rats without any experimental treatment； group B was the rats with liver failure， and the rats were injected with 1 mL normal saline at caudal vein 12 hours after modeling； group C was the treatment group of rhubarb extract， at 12 hours after modeling at caudal vein， rhubarb extract（10 mL/kg） was intraperitoneally injected 3 times a day for a continuous injection of 2 days. Rats in each group were injected with 10% of chloral hydrate after anesthesia for 48 hours. Portal vein blood samples and liver tissue specimens were collected for the observation of test indices. Results Rats in group B showed acute liver failure after modeling， and group A， group C were without or only with a small number of symptoms. The levels of serum ALT， AST and TBiL in group B 48 h after modeling were significantly increased， and the levels were reduced in group C. Conclusion Rhubarb extract is beneficial to promoting the recovery of acute liver failure rats， and can promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and enhance the therapeutic effect of BMSCs transplantation. This therapy can promote the regeneration and repair of liver cells， and provide certain treatment for the patients with liver dysfunction.

[Key words] Rhubarb extract； Acute liver failure； Emodin

急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）是指由一系列復杂原因造成患者肝脏细胞大量坏死，导致肝功能急剧丧失并出现黄疸、腹水等一系列并发现象的肝功能障碍[1-4]。急性肝功能衰竭的病因多种多样，在我国主要是由急性肝炎所致，不过药物或者毒物中毒也是很重要的一个病因[5-7]。目前针对ALF患者的主要治疗方式为肝脏移植，不过这种方式也有很大的弊端，主要包括费用昂贵、肝源不足等。由于治疗急性肝衰竭的关键在于增加正常肝细胞的数量以及减少坏死的肝细胞数量，因此目前也可以采用干细胞移植方式对患者进行治疗[8，9]。大黄提取物的主要成分为大黄素（emodin，EMD），研究表明大黄素可以抑制癌细胞的DNA、RNA和蛋白质的生物合成，抑制癌细胞的氧化脱氢；同时大黄素对于微生物生长也有一定的抑制作用[10]。有研究表明，向大鼠腹腔注射大黄素可以降低大鼠的免疫系统功能、减少抗体产生、降低白细胞数目并抑制吞噬细胞的吞噬功能[11]。因此本试验探讨大黄提取物治疗方法对急性肝功能衰竭大鼠的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 清洁级健康雌性SD大鼠共15只，体重均在200 g左右，实验大鼠来自温州医科大学实验动物中心。

1.1.2 试验试剂 D-氨基半乳糖购自上海润成生物科技有限公司，大黄素购自南京普怡生物科技有限公司，胎牛血清及低糖DMEM培养液购自Hyclone公司，ELISA试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司。

1.2 方法

将15只试验大鼠随机分为3组，每组各5只。A组为健康大鼠，不施加任何试验处理；B组为肝衰竭大鼠，造模后12 h尾静脉注射1 mL生理盐水；C组为大黄提取物治疗组，造模后12 h于腹腔注射大黄提取物（10 mL/kg），每日3次，连续注射2 d。各组大鼠均在造模48 h之后注射10%的水合氯醛进行麻醉，取门静脉血以及肝组织标本进行试验指标检测。

1.3 观察指标

1.3.1 一般观察 各组大鼠处死之前，连续观察大鼠的精神状态、采食情况以及活动状态，记录大鼠巩膜以及小便颜色等情况。

1.3.2 肝功能检测 通过门静脉采取大鼠血清标本，利用全自动生化分析仪检测常见肝功能指标：血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBiL）。

1.3.3 肝组织病理学观察 取肝组织，用10%的甲醛固定后脱水制作石蜡切片，HE染色，光镜下观察。采用半定量分析法评价肝组织病变：0分为正常，标记为“-”；1分表示肝细胞点状坏死，标记为“+”；2分表示肝细胞少量坏死，标记为“++”；3分表示肝小叶肝细胞大量坏死，标记为“+++”；4分表示肝细胞几乎全部坏死，标作“++++”。

1.3.4 血清IL-1及TNF-α的含量检测 采用ELISA双抗夹心法进行检测，按照试剂盒说明书进行操作。

1.4统计学处理

数据采用SPSS19.0 统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析和LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般观察

与A组大鼠进行比较，造模12 h后B组大鼠表现出肝功能衰竭的症状，如食欲减退、活动减少、精神不振以及嗜睡现象，少数大鼠还出现了尿色深黄现象。造模24 h后B组大鼠出现持续昏睡现象，对于外界刺激反应不明显，偶有口腔鼻腔出血现象。造模48 h后B组大鼠开始进入深度昏迷，几乎丧失生命症状。C组大鼠与A组大鼠相比几乎没有上述现象出现，或仅有少量大鼠出现轻微的症状，且持续时间很短。

2.2 各组肝功能检测比较

与A组大鼠相比，B组大鼠在造模48 h后血清ALT、AST以及TBiL含量均出现显著上升。与B组相比，C组大鼠血清各指标含量下降且有统计学差异。见表1。

2.3 肝组织病理学观察

大鼠肝组织损伤观察主要从肝小叶结构、肝细胞坏死以及出血情况进行评分，采用半定量分析法进行判定。与A组对比，B组观测到肝小叶结构被明显破坏，肝细胞形态膨胀，出现大面积的细胞坏死现象，肝窦扩张并且伴有出血现象。C组可观测到部分肝小叶结构被破坏，肝细胞出现点状坏死，部分区域出现炎细胞浸润，但相对于B组仍然有较多正常的肝细胞，见表2，细胞镜下观察图片见封三图3。

2.4各组血清IL-1及TNF-α含量检测

与A组相比，B组、C组大鼠血清炎症指标均在造模后48 h迅速上升，组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3讨论

急性肝功能衰竭主要是由于大量的肝细胞坏死导致的，临床表现为出现意识障碍并伴随黄疸现象，呼气有特殊的甜酸味，偶有肠胃出血现象，并发其他器官出现功能性障碍如肾功能降低等[12]。目前肝衰竭的治疗方法仅有肝移植，可是肝移植也有很大的弊端，如肝源的短缺以及患者的免疫排斥反应、手术风险大、费用昂贵等[13]。但是随着细胞移植技术的不断成熟，现在针对肝衰竭的治疗方法包括骨髓间充质干细胞移植，这种治疗方式不仅可以增加患者正常肝细胞数量，也可以对等待进行肝移植的患者起到缓解作用，防止患者在等待期间肝细胞大量坏死而导致肝脏功能完全丧失，不过目前这种治疗方式仍然处于研究阶段。

大黄提取物的主要成分为大黄素，研究表明大黄素具有抗肿瘤和抑制免疫功能等作用，研究发现[14]，大黄素能减少肝损伤后肝组织中炎症细胞的分泌，抑制肝细胞坏死。大黄素为蓼科植物虎杖的干燥根茎和根，属植物型药剂，有多种药理药效。其中包括：（1）抗肿瘤活性作用：大黄素可以抑制小鼠肝癌、乳腺癌等多种癌症，通过抑制癌细胞遗传物质和蛋白质的生物合成控制肿瘤的发展和扩散；（2）抗微生物生长作用；（3）免疫抑制作用；（4）小剂量对离体蟾蜍心脏有兴奋作用，而大剂量则有抑制作用[15，16]。

在本次研究中，大黄素注入治疗后，C组大鼠表现为轻微的肝功能衰竭现象，且血清ALT、AST以及TBiL相对于B组大鼠下降，说明大黄素对急性肝功能衰竭大鼠的肝脏有一定的修复作用。其原因可能在于大黄素刺激骨髓间质干细胞分化形成正常的肝细胞，补充因为大量肝细胞坏死而导致的肝功能代偿性丧失，以及由于进入肝脏组织的大黄提取物含有微量物质，可能会促进肝细胞分泌活性物质以及生长因子，这些物质也可以促进肝脏细胞的自我修复从而缓解肝损伤[17-19]。C组大鼠血清中炎性因子出现一定程度的下降，说明大黄提取物可以抑制肝组织的炎症反应，减少炎性细胞的产生和浸润，可能由于促进肝细胞分泌多种细胞因子和生长因子抑制炎症反应[20]。有研究表明大黄素可以通过抑制巨噬细胞的激活减少炎性因子的释放，所以能更大程度地修复受损的肝细胞，分析大黄素能修复受损肝细胞的原因还可能包括大黃素可以调控细胞纤维化过程。有研究发现，大黄素能够促进凋亡蛋白的表达调控细胞凋亡过程，而大黄素通过这一过程可促进肝细胞凋亡降低肝细胞的纤维化。曾有研究表明，炎性因子TNF-α在肝损伤的过程中起到重要的作用[15，16]，在本研究中也证明了以上观点：肝损伤程度与炎性因子TNF-α含量呈正相关，因此在临床治疗上，可以尽量抑制肝脏的炎症反应以减少对肝组织的损伤。

综上所述，大黄提取物可以对肝衰竭起到一定的治疗作用，通过大黄提取物可以改善肝脏内环境，减少炎性因子的分泌，治疗肝衰竭以及促进肝细胞再生。

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（收稿日期：2017-01-23）