C—erbB—2、p—Akt蛋白在乳腺癌中的表达水平及其在保留NAC的乳腺癌手术中的临床意义研究

盛贤能　郭宇　鲁杨　王金秋

[摘要] 目的 探討C-erbB-2、p-Akt蛋白在乳腺癌中的表达水平及其在保留NAC乳腺癌手术中的临床意义。 方法 自2010年6月～2011年3月，随机选择86例经穿刺病理诊断确诊乳腺非浸润性导管癌，且符合保留NAC乳腺癌手术的女性患者为患者组。在我院健康体检中心随机选择86例健康女性为健康对照组。对患者组患者进行保留NAC乳腺癌手术，术后对癌组织及癌旁正常组织进行免疫组化染色。检测C-erbB-2、p-Akt蛋白在癌组织及癌旁正常组织中的表达水平。使用ELISA法对患者手术前后及健康对照组外周血的C-erbB-2、p-Akt表达水平进行检测，记录各组数据并进行统计学分析。按照C-erbB-2、p-Akt表达情况分为双阳性、双阴性以及单阳性。使用Kaplan-Meier法分析患者生存预后。 结果 在乳腺癌组织及癌旁正常组织中，C-erbB-2、p-Akt蛋白均有表达，但在癌组织表达水平明显高于正常组织，差异具有统计学意义（P<0.05）。乳腺癌患者外周血C-erbB-2、p-Akt与健康对照组相比均明显升高。Kaplan-Meier法分析患者生存预后发现，C-erbB-2、p-Akt均阳性表达者生存率明显降低，总生存期明显缩短，差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论 乳腺癌患者外周血C-erbB-2、p-Akt水平明显高于健康对照组，C-erbB-2、p-Akt对患者接受保留NAC乳腺癌术后生存期有重要的临床意义。

[关键词] 乳腺癌；C-erbB-2；p-Akt；乳头乳晕复合体

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）12-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the expression level of C-erbB-2 and p-Akt proteins in breast cancer and its clinical significance in breast cancer surgery reserving NAC. Methods From June 2010 to March 2011， 86 patients who were diagnosed with noninvasive ductal carcinoma of the mammary gland by biopsy pathological diagnosis and eligible for breast cancer surgery reserving NAC were randomly selected as the patients group. Another 86 healthy women were selected as the control group， randomly selected from the Physical Examination Center in our hospital. The enrolled patients were given the breast cancer surgery reserving NAC. Immunohistochemical staining was performed on cancer tissues and adjacent normal tissues after the surgery. The expression levels of C-erbB-2 and p-Akt in cancer tissues and adjacent normal tissues were detected， and the expression levels of C-erbB-2 and p-Akt in the peripheral blood before and after the surgery and in the healthy control group were detected by ELISA. The data of each group were recorded and analyzed statistically. According to the expression of C-erbB-2 and p-Akt， the expression was divided into double positive， double negative and single positive. Kaplan-Meier method was used to analyze the prognosis of patients. Results C-erbB-2 and p-Akt proteins were expressed in breast cancer tissues and adjacent normal tissues， but the expression levels in cancer tissues were significantly higher than those in normal tissues. The difference was statistically significant（P<0.05）. The levels of C-erbB-2 and p-Akt in the peripheral blood of patients with breast cancer were significantly higher than those in the healthy control group. Kaplan-Meier method was used to analyze the survival prognosis， indicating that the survival rate of the patients with positive C-erbB-2 and p-Akt was significantly decreased， the overall survival time was significantly shorter， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The levels of C-erbB-2 and p-Akt in peripheral blood of the patients with breast cancer are significantly higher than those in healthy control group， and C-erbB-2 and p-Akt have important clinical significance in the postoperative survival period of the patients receiving breast cancer reserving NAC.

[Key words] Breast cancer； C-erbB-2； p-Akt； Nipple-areola complex （NAC）

乳腺癌是指乳腺上皮细胞的恶性肿瘤，占女性所有恶性肿瘤的20%以上，成为威胁女性身体健康的重要杀手[1]。随着乳腺癌患者对生活质量的要求越来越高，患者对术后美观程度的要求也越来越高，保留乳头乳晕复合体的乳腺癌根治术也得到了广泛的应用[2]。保留乳头乳晕复合体（nipple-areolar complex， NAC）对乳腺癌患者乳房重建的美容效果和术后生活质量有重要意义。但是保留NAC的乳腺癌术后风险即复发研究尚不明确[3]。因此，探讨保留NAC的乳腺癌术后标志物对于研究其发病机制以及疾病预后具有重要的临床意义[4]。本研究主要使用C-erbB-2、p-Akt蛋白聯合评价保留NAC手术后患者的生存预后，并进一步探讨C-erbB-2、p-Akt蛋白的临床意义。

1 资料与方法

1.1临床资料

自2010年6月～2011年3月，随机选择86例经穿刺病理诊断确诊乳腺非浸润性导管癌，且符合保留NAC乳腺癌手术的女性患者为患者组。在我院健康体检中心随机选择86例健康女性为健康对照组。两组年龄、BMI等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。

1.2乳腺癌患者入组标准[5]

（1）自2010年6月～2011年3月，在我院通过病理学诊断确诊乳腺癌的患者。（2）入组患者均为女性，年龄42～67岁，临床资料及病理资料均完整；（3）入组患者均需要符合保留乳头乳晕复合体乳腺癌手术标准，即：①适用于Ⅰ、Ⅱa期乳腺癌患者；②非中央区乳腺癌，肿瘤边缘距乳晕边缘直线距离≥3 cm；③肿瘤最大径≤3 cm；④乳头无溢液、无湿疹样改变、无内陷及歪斜等异常表现；⑤乳晕及边缘皮肤无桔皮样改变；⑥保留的乳头乳晕区皮下组织取样冰冻病理报告无癌细胞浸润。（4）患者术前未接受放疗或化疗等治疗。

1.3 乳腺癌患者排除标准

（1）合并其他系统的恶性肿瘤，不包括乳腺癌转移到其他病灶者；（2）不能明确诊断者；（3）认知障碍或患精神疾病者；（4）某些原因导致未能取得病理样本者；（5）患者或家属不配合；（6）某些原因导致中途退出本研究者；（7）患者一般情况较差，不适合进行检查及治疗者。（8）患者术前接受过放疗或化疗等治疗。

1.4免疫组化方法

乳腺癌组织石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2，20℃孵育10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min重复两次；使用5%PBS稀释的山羊血清（Life Technologies，美国）封闭，20℃孵育10 min，倒去山羊血清，滴加一抗（anti-C-erb-2，anti-p-Akt，ab60709，Abcam，美国），在37℃下孵育1～2 h或在4℃冰箱中过夜保存；将“生物素标记二抗”（Perkin-Elmer）工作液滴加适量到样品上，37℃孵育10 min；滴加辣根过氧化物酶（Sigma，S7571，美国），37℃孵育10 min；向1 mL DAB Plus Substrate（TA-125-HDX，Thermo Scientific，美国）中滴加1～2滴DAB Plus Chromogen（TL-125-HD，Thermo Scientific，美国），混匀后滴加到切片上，37℃孵育10 min后，冲洗封片。

1.5 ELISA检测方法

采用酶联免疫吸附（ELISA）实验检测患者血清C-erbB-2、p-Akt蛋白的表达水平，本研究所有试剂均购于武汉博士德生物工程有限公司，操作完全按照说明书进行。

1.6 手术方法

局麻下小切口（4～5 cm）切除肿瘤，病理结果报告为癌后，在全麻下行保留NAC的乳腺癌改良根治术。以活检切口为轴，在距切口皮肤3～5 cm左右作一梭形切口，切除乳腺肿瘤表面的部分皮肤，向四周游离皮瓣，皮瓣下留有薄层脂肪，保留乳头乳晕，其基底部留有薄层腺体组织，术中取样冰冻切片。由内下沿胸大肌表面向上外连同胸肌筋膜一并切除至胸大肌外侧缘， 根据清除腋淋巴结的需要而延长切口或另行选择切口，拉起胸大肌外侧缘，清除腋窝淋巴结，整块切除手术标本。如诊断为浸润性癌者，术后需要接受化疗。

1.7 观察指标

观察患者手术前后ELISA检测、免疫组化检测结果及术后5年生存率。

1.8 统计学方法

对所收集资料采用SPSS 15.0统计学软件处理，计量资料用（x±s）表示，组间对比采用独立样本t检验；计数数据用例数或构成比表示，采用χ2检验。采用Log Rank时序检验以及COX多因素分析对患者临床预后进行分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者组及健康对照组一般临床资料比较

患者组及健康对照组一般临床资料比较，两组无明显统计学差异（P>0.05）。见表1。乳腺癌患者病理类型均为导管癌。

2.2 ELISA检测结果

手术前后使用ELISA法检测患者外周血C-erbB-2、p-Akt蛋白表达水平发现，术前患者组外周血C-erbB-2、p-Akt蛋白水平均明显高于健康对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。术后患者组外周血C-erbB-2蛋白水平明显减低至（1.805±0.001）ng/mL，低于术前（2.814±0.825）ng/mL（P<0.05），但与健康对照组相比，水平明显较高，差异具有统计学意义（P<0.05）。p-Akt结果发现，术后患者组血清p-Akt水平明显减低，但与健康对照组相比则明显较高，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 免疫组化结果

术中留取患者乳腺癌组织以及癌旁正常组织进行免疫组化染色，我们发现，C-erbB-2、p-Akt蛋白在患者乳腺癌组织以及癌旁正常组织中均有表达，但乳腺癌组织中表达水平明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义（P<0.05）。见封三图1 A～E。

2.4 生存预后分析

使用Kaplan-Meier法对术后随访患者的5年生存率进行分析并最终发现，癌组织C-erbB-2、p-Akt双阳性患者中位生存期和5年总生存率明显低于单阳性者和双阴性者，见封三图2。

3 讨论

随着女性乳腺癌患者对生活质量和形体美的要求越来越高，保留乳头乳晕的乳腺癌根治术的应用越来越广泛[6]。目前临床上通常使用保乳手术联合Ⅰ期或Ⅱ期乳房再造手术进行治疗[7]。但是，大部分东方女性乳房体积较小，如限制切除范围则影响手术治疗效果，这也是目前保乳手术治疗的主要障碍[8]。探索特异性的肿瘤标志物可能对预测手术风险以及预后提示具有重要意义[9]。

C-erbB-2基因又称为neu或HER-2基因，是一种细胞原癌基因，在多种肿瘤中其癌基因及其蛋白产物（P185）均有过度表达和扩增[10-11]。对C-erbB-2癌基因蛋白产物P185的病理研究首先多见于乳腺癌，其作用也较为明确[12]。目前普遍认为，C-erbB-2蛋白产物的阳性表达可作为判断乳腺癌预后的一个独立指标[13]。本研究发现，在乳腺癌患者中，癌旁正常组织及乳腺癌组织中均可见C-erbB-2蛋白表达，但癌组织中表达水平明显增高，这一结果与既往研究较为相似，在多种女性有关的肿瘤中，均可见C-erbB-2表达异常，包括子宫内膜癌[14]、卵巢癌[10]以及乳腺癌[15]等。此外，C-erbB-2也可以通过与胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）联合作用共同調控卵巢癌的发生发展[10]。有研究结果提示，乳腺癌的发生可能与C-erbB-2基因异常表达有关[16]。

p-Akt是磷酸化的Akt，既往报道Akt信号通路在多种癌症疾病中均有表达，如肺癌[17]、胃癌[18]等常见肿瘤。目前，Akt及其信号通路是基础研究和药物研发领域中最热门的激酶和激酶通路之一[19]。PI3K/Akt信号通路对于细胞增殖、分化和凋亡的调节是必要的，其活化与肿瘤发生及肿瘤侵袭转移密切相关[20]。在Hela细胞中，有研究发现，干扰素β可以通过NF-κB/p-Akt的信号通路有效促进低剂量顺铂的治疗作用[21]。本研究发现，在乳腺导管癌患者中，p-Akt蛋白在健康乳腺组织、癌组织和癌旁正常组织中均有表达，但在癌组织中表达水平明显高于正常组织，差异具有统计学意义（P<0.05）。这一结果表明，Akt信号通路在乳腺组织癌变的过程中也发挥了重要的作用。

此外，运用Kaplan-Meier分析本组乳腺癌患者生存情况后发现，C-erbB-2和p-Akt双阳性的乳腺癌患者5年生存率明显低于单阳性者与双阴性的乳腺癌患者，差异具有统计学意义（P<0.05）。我们分析，C-erbB-2和p-Akt高表达可能提示乳腺癌患者体内的癌组织处于旺盛的增殖状态。此外，由于保留NAC乳腺癌手术的切除范围较为有限[23]，在这部分患者中可能存在潜在的乳腺癌转移灶，影响了患者的临床预后。因此，我们认为，对于外周血检测C-erbB-2和p-Akt表达水平增高的非浸润性乳腺癌患者而言，并不适合进行保留乳头乳晕复合体的治疗方法。

综上所述，乳腺癌患者外周血C-erbB-2、p-Akt水平明显高于健康对照组，检测C-erbB-2、p-Akt的表达水平对患者接受保留NAC乳腺癌术后的总生存期有重要的临床意义。

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（收稿日期：2017-02-24）