Toll样受体-4基因启动子区多态性与急性心肌梗死发病风险的关系

孙丹丹，吴玉鹏，杨军，刘文，闫虹，王红鹄

(中国医科大学附属第一医院，沈阳110001)

Toll样受体-4基因启动子区多态性与急性心肌梗死发病风险的关系

孙丹丹，吴玉鹏，杨军，刘文，闫虹，王红鹄

(中国医科大学附属第一医院，沈阳110001)

目的 探讨Toll样受体-4(TLR4)基因多态性与急性心肌梗死(AMI) 发病风险的关系。方法 选取AMI患者244例(AMI组)和非AMI患者284例(对照组)，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测两组TLR4基因启动子区多态性(rs10116253和rs10983755)，比较两组TLR4启动子区多态性的基因型分布差异，采用多因素Logistic 回归模型分析TLR4基因启动子区多态性与AMI发病风险的关系。结果 TLR4基因rs10116253、rs10983755均符合Hardy-Weiberg平衡。TLR4启动子区rs10116253和rs10983755多态性与AMI的总体发病风险无关(P均>0.05)。对于TLR4基因rs10116253多态位点，男性TC突变杂合型携带者AMI的发病风险是TT野生纯合型携带者的0.50倍， TC+CC突变型携带者AMI发病风险是TT野生纯合型携带者的0.51倍,伴有高血脂的TC杂合型携带者AMI发病风险是TT野生纯合型携带者的0.42倍，TC+CC突变型携带者AMI发病风险是TT野生纯合型携带者的0.46倍,差异均有统计学意义(P均<0.05)。TLR4基因rs10983755多态位点在性别、年龄、有无高血压、有无糖尿病及有无血脂异常等分层分析中均未见统计学差异(P均>0.05)。结论 TLR4基因启动子区rs10116253多态性与AMI分层发病风险存在关系；rs10116253突变基因型可以降低男性人群、伴有高血脂人群AMI的发病风险。

急性心肌梗死；Toll样受体-4；基因多态性

目前认为，急性心肌梗死(AMI)是遗传因素及环境因素共同作用的复杂性疾病[1，2]。作为炎症反应的第一道屏障，Toll样受体-4(TLR4)参与AMI的发生发展过程，与斑块的稳定性密切相关[3]。研究表明，TLR4基因多态性与糖尿病、缺血性脑血管病、颈动脉内膜增厚等有关[4～6]。但是，TLR4基因启动子区多态性与中国汉族人群AMI发病风险的关系尚未见报道。故本研究对TLR4基因启动子区多态性与AMI发病风险的关系进行了探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取中国医科大学附属第一医院心血管内科2013年9月～2015年9月收治的符合2002年AHA/ACC关于AMI诊断标准的患者244例(AMI组)，男104例、女140例，年龄27～84(58.96±11.40)岁；吸烟112例(46.1%)，饮酒40例(16.5%)，高血压156例(63.9%)，糖尿病83例(34.0%)，高血脂138例(56.6%)。选择同期住院非AMI患者284例(对照组)，男122例、女162例，年龄19～87(57.93±11.11)岁；吸烟73例(25.3%)，饮酒40例(13.8%)，高血压156例(54.9%)，糖尿病57例(20.1%)，高血脂112例(39.4%)。对照组冠状动脉造影显示冠状动脉狭窄<50%，且对造影检查知情同意。两组均排除恶性肿瘤、自身免疫系统疾病、肝肾功能不全及近期急慢性感染性疾病。两组比较，性别、年龄、饮酒情况无统计学差异(P均>0.05)，吸烟、糖尿病、高血脂情况有统计学差异(P均<0.05)。

1.2 TLR4基因启动子区多态性检测 ①TLR4启动子区潜在功能性单核苷酸多态性(SNP)的选取：从HapMap数据库(http://www.HapMap.org)下载TLR4启动子区的基因型信息(Release27，PhaseⅠ+Ⅱ+Ⅲ)，利用Haploview4.0则进行SNP的筛选，筛选原则为: 中国人群、SNP位于-5 000～500 bp、最小等位基因型频率≥5%、配对决定系数r2>0.8。对筛选出的SNP进一步进行功能预测，选取具有潜在与转化因子结合能力的SNP，即rs10116253和rs10983755，进入随后的分析研究。②基因组DNA提取：抽取两组患者外周静脉血5 mL装于促凝试管内，分离血清和凝血块。酚氯仿法提取人全血基因组DNA。③TLR4基因分型：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术进行TLR4基因rs10116253和rs10983755多态性分型检测。正向引物序列分别为： 5′-TAAAAGCCAGGTAGAGGAGGG-3′，5′-TGACAGACCATCAAGAACACAGAAAAG-3′。反向引物序列分别为：5′-GAAAGAAGCAAGTGCAATGTAGT-3′，5′-GAAAGTAGCAAGTGCAATGTGTAA=3′。PCR反应体系(25 μL)：10×PCR Buffer 2.5 μL(含MgCl225 nmol/L)，50 μmol/L的dNTP 2 μL，0.2 μmol/L上下游引物各0.5 μL，2.5 U的Taq酶0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，去离子水18 μL。PCR反应条件: 94 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环，72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR产物与限制性核酸内切酶于37 ℃温育过夜。全部酶切产物于3.0%琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统观察分析电泳结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行数据处理。计数资料以频率表示，组间比较采用χ2检验；TLR4启动子区基因型与AMI发病风险的关系采用多因素Logistic 回归模型分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLR4基因启动子区多态性分型 TLR4基因rs10116253、rs10983755均符合Hardy-Weiberg平衡。TLR4基因rs10116253野生纯合型TT为两个片段，分别为470 bp和131 bp；突变杂合型TC为三个片段，分别为601 bp、470 bp和131 bp；突变纯合型CC为一个片段，601 bp。TLR4基因rs10983755野生纯合型GG为两个片段，分别为342 bp和121 bp；突变杂合型GA为三个片段，分别为463 bp、342 bp和121 bp；突变纯合型AA为一个片段，463 bp。

2.2 两组TLR4启动子区多态性的基因型分布 两组TLR4启动子区rs10116253基因型、rs10983755基因型分布比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表 1 两组TLR4启动子区多态性基因型分布[例(%)]

2.3 TLR4基因启动子区多态性与AMI总体发病风险的关系 对TLR4基因启动子区rs10116253和rs10983755多态基因型与AMI总体发病风险的关系进行分析，显示rs10116253和rs10983755多态性与AMI的总体发病风险无关(P均>0.05)。见表2。

表2 TLR4基因启动子区多态性与AMI总体发病风险的关系

注：调整年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高血脂等非分组参数后。

2.4 TLR4基因启动子多态性与AMI分层发病风险的关系 在性别分层中，对于TLR4基因rs10116253多态位点，男性TC突变杂合型携带者AMI的发病风险是TT野生纯合型携带者的0.50倍，男性TC+CC突变型携带者AMI发病风险是TT野生纯合型携带者的0.51倍，差异均有统计学意义(P均<0.05)。在有无高血脂分层中，对于TLR4基因rs10116253多态位点，伴有高血脂的TC杂合型携带者AMI发病风险是TT野生纯合型携带者的0.42倍，伴有高血脂的TC+CC突变型携带者AMI发病风险是TT野生纯合型携带者的0.46倍，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。但TLR4基因rs10983755多态位点在性别、年龄、有无高血压、有无糖尿病及有无血脂异常等因素的分层分析中均未见统计学差异(P均>0.05)。见表4。

表3 TLR4基因启动子区rs10116253多态性与AMI分层发病风险的关系

注：调整年龄、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病等非分组参数后。

表4 TLR4基因启动子区rs10983755多态性与AMI分层发病风险的关系

注：调整年龄、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病等非分组参数后。

3 讨论

TLR4是第1个被发现的哺乳动物Toll样受体，属于Ⅰ型跨膜蛋白，参与天然免疫反应，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁[7]。随着分子生物学研究对TLR4与动脉粥样硬化(AS)发生发展的密切关系逐渐揭示，TLR4基因多态性与AMI发病风险的关系也引起了越来越多学者的关注。研究表明，位于TLR4基因第三外显子编码区的rs4986790及rs4986791多态位点在高加索人群导致了Asp299Gly氨基酸的改变，引起TLR4信号通路受损，导致炎症反应减弱，还可影响脂质代谢和降低急性冠脉综合征患者血浆中纤维蛋白原和可溶性VCAM-1的水平，减少急性冠脉综合征的发生[8]。但TLR4 Asp299Gly多态性研究在不同人种间分布不均，在欧洲高加索人种多有报道，而在韩国、日本及中国等亚洲人群中对TLR4 Asp299Gly多态性的研究报道较少[9]。迄今为止，TLR4基因启动子区多态性与中国汉族人群AMI发病风险的关系尚未见报道。

本研究表明，在中国人群中TLR4基因启动子区rs10116253多态性与AMI的发病有关。其分子机制可能为以下几点。首先，作为天然免疫的第一道屏障，TLR4不但能识别一些外源性配体，如革兰阴性菌的脂多糖(LPS)、革兰阳性菌的脂磷壁酸和衣原体的热休克蛋白60(HSP60)[10]，还能识别一些内源性配体，如HPS60、纤维连接蛋白正蛋白结构域A片段、透明质酸和轻度修饰的低密度脂蛋白，这些配体均被证实与AS的发生相关[11]。其次，TLR4能在AS形成细胞表面表达，不但介导血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等血管细胞的病变，还能活化树突状细胞、单核/巨噬细胞等免疫细胞产生的炎性因子，诱导AS的发生发展[12]。其中重要的一点是AMI的发生与局部斑块的不稳定性密切相关，而后者是炎症反应进展的结果。有研究表明，敲除TLR4的ApoE-/-小鼠模型斑块体积明显减少，斑块中的脂质和巨噬细胞浸润均降低，促炎因子表达显著下调，这使得斑块稳定且不易破裂[3]。已有研究证实，LPS通过TLR4介导基质金属蛋白酶9、蛋白水解酶表达[13]，两者可降解细胞外基质引发斑块不稳定。还有研究表明，细胞调亡亦可促进斑块不稳定发展。斑块的破裂多发生在其肩部，平滑肌细胞的调亡可使斑块肩部无法起到支撑作用，同时平滑肌细胞及基质的减少导致纤维帽形成障碍，两者均可促进斑块不稳定。已有报道TLR4信号途径可诱导调亡分子表达，促进平滑肌细胞凋亡而引发斑块不稳定[14]。

本研究发现，TLR4基因启动子区rs10116253突变基因型可以降低男性患者AMI的发病风险。多数研究表明，由于雌激素对AS有保护作用，男性是罹患AMI的高发人群。但是，Rettew等研究表明，雌激素可以通过TLR4介导促炎反应。雌激素可以上调巨噬细胞TLR4表达，并进一步促进炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的分泌[15]。本研究还观察到，TLR4基因启动子区rs10116253多态位点突变基因型可以降低高血脂人群的AMI发病风险。近年来越来越多的研究表明，TLR4的内源性配体弱氧化修饰低密度脂蛋白(mmLDL)在AS的发病机制中发挥了重要作用。Choi等研究表明，mmLDL通过与TLR4结合诱导的巨噬细胞吞噬作用，最终导致脂质在巨噬细胞中的积累[16]。首先，TLR4基因启动子区rs10116253多态位点可能通过改变转录因子结合能力导致TLR4的表达减少，进而影响减低AMI的发病风险。其次，基于以上研究阐述的雌激素及mmLDL对TLR4的作用，TLR4启动子区rs10116253多态位点更易于降低男性患者或伴有高血脂患者的AMI的发病风险。

综上所述，TLR4基因启动子区rs10116253多态性与AMI发病风险存在关联，rs10116253突变基因型可以降低男性人群、伴有高血脂人群AMI的发病风险，此为临床AMI易发人群早期预警及个性化治疗提供了理论依据。但是，本研究结果的客观真实性仍需要通过对TLR4基因rs10116253多态位点功能的相关研究来进一步验证。

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Relationship of promoter polymorphisms of Toll-like receptor 4 with risk of acute myocardial infarction

SUNDandan,WUYupeng,YANGJun,LIUWen,YANHong,WANGHonghu

(TheFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Objective To investigate the association between the promoter polymorphisms of Toll-like receptor 4 (TLR4) and the risk of acute myocardial infarction (AMI) in Northern Chinese Han population. Methods Two hundred and forty-four patients with AMI (AMI group) and 284 patients without AMI (control group) were enrolled in this study. Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism was performed to detect the promoter polymorphisms of TLR4 (rs10116253 and rs10983755). The distributions of genotypes were evaluated by Chi-square (χ2) test. The association between each SNP and CAD risk was determined using multiple logistic regression analysis. Results The distributions of TLR4 rs10116253 and rs10983755 were in Hardy-Weinberg equilibrium. The TLR4 rs10116253 and rs10983755 polymorphisms were not associated with the total risk of AMI (allP>0.05). Compared with those carriers with wild TT genotype, male carriers with variant TC genotype had a 50% lower AMI risk. Compared with the male carriers with wild TT genotype, male carriers with variant genotype (TC+CC) had lower AMI risk by 0.51 fold. Compared with the hyperlipidemic patients with the wild TT genotype, the patients with the TC variant genotype had lower AMI risk by 0.42 fold. In comparison with the hyperlipidemic patients with wild TT genotype, the patients with variant genotype (TC+CC) had lower AMI risk by 0.46 fold. Significant difference was found between them (allP<0.05). However, TLR4 rs10983755 polymorphism showed no statistical significance in the stratification analysis including sex, age, with or without hypertension, with or without diabetes mellitus and with or without dyslipidemia (allP>0.05). Conclusion Our results reveal an association between the promoter polymorphism rs10116253 of TLR4 and AMI risk. The variant genotype of TLR4 rs10116253 can reduce the risk of AMI in male subjects or subjects with hyperlipidemia.

acute myocardial infarction; Toll-like receptor 4; gene polymorphisms

辽宁省自然科学基金计划项目(2015020506)。

孙丹丹(1983-)，女，主治医师，博士，研究方向为心血管超声诊断及心血管疾病的基因多态性。E-mail：dan_101912@163.com

孙丹丹

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.006

R542.2

A

1002-266X(2017)17-0017-04

2016-12-08)